利用FRET流式细胞术灵敏检测蛋白质病理性种子活性

本实验的总体目标是从重组或生物来源中检测促淀粉样蛋白种子活性，从而实现对蛋白质、蛋白聚集体及样本的高灵敏度检测。该方法有助于解答神经退行性疾病领域中的关键科学问题。例如，在疾病动物模型中，如何对治疗干预后种子活性的定量变化进行评估？

该技术的优点包括对低水平蛋白质聚集体具有高特异性。其卓越的特异性、操作简便性以及高通量特性。今天将由我本人与合著者 Brandon Holmes 一同演示该实验流程。

准备生物种子材料时，首先用一次性称量舟称取冷冻脑组织。然后将组织转移至一个锥形管中，加入预冷的匀浆缓冲液，使终体积浓度为10%，并将样品置于冰上转移至冷室。接着，将探头调节至适当设置，并用冰水冲洗探头的侧面和底部。

按照所示方法用指示剂冲洗探针尖端三次，每次更换溶液之间需将探针擦拭干净。当探针准备就绪后，将探针尖端浸入一个样品的匀浆缓冲液中，开始超声处理，共施加25次总脉冲。当组织完全悬浮后，离心匀浆液，并将上清液转移至洁净的离心管中。

注意操作时不要扰动腭部。尽管目前有多种其他均质化技术可用，但本方法在从生物样本中分离少量原代病理种子方面更具优势。机械解离可实现组织的一致且高效的破碎，进而实现种子的后续提取。

然后将上清液分装，并将裂解物于-80摄氏度保存。在无菌条件下重新培养生物传感器细胞时，用预热的PBS洗涤每种细胞系，随后加入胰蛋白酶EDTA孵育3分钟。当细胞脱落时，用预热的培养基终止反应，并立即将细胞转移至锥形管中。

将细胞重悬液离心，用新鲜培养基重悬沉淀。然后计数细胞，并配制每13毫升培养基中含有3,500,000个细胞的主混合细胞稀释液。使用多通道移液器，缓慢将130 µL细胞悬液转移至平底组织培养处理的96孔板的每孔中，注意将移液器吸头置于孔中央，避免接触孔底。

细胞接种后，于室温静置10分钟，使其沉降，随后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳及相对湿度大于等于80%的培养箱中过夜培养。次日当生物传感器细胞融合度达到60%至65%时，将减血清培养基、脂质体试剂和生物种子来源混合，制备转导复合物。然后用移液器沿每个生物传感器孔的孔壁缓慢加入20微升转导复合物，将处理后的细胞重新放回培养箱继续培养24至48小时，之后进行收获。

未经处理的细胞仅显示弥散性荧光。然而，经 tau 种子材料处理的细胞将在一至两天后出现明亮的聚集物。收集细胞时，用 50 µL 胰蛋白酶-EDTA 替换细胞培养基以终止反应。孵育 5 分钟后，加入 150 µL 冷培养基，立即将细胞转移至 96 孔圆底板中，离心形成细胞沉淀，小心吸除上清液而不扰动沉淀，随后在 50 µL 2% 多聚甲醛中轻柔而充分地重悬细胞，固定 10 分钟。

然后再次离心细胞，并尽快将沉淀重悬于200 µL预冷的流式细胞术缓冲液中。固定后，将孔板装载到兼容FRET的流式细胞仪上，生成侧向散射面积对前向散射面积按变异株的散点图。接着在细胞系一运行时，调节侧向散射和前向散射电压，直至细胞群位于左下象限。

然后使用多边形工具，将细胞群体定义为门控 P1。接下来创建前向散射高度（FSC-H）与前向散射面积（FSC-A）的变异散点图，并应用 P1 门控。接着，将单细胞定义为门控 P2，并分别生成一个直方图。

对于C-F-P-Y-F-P和fret滤光片，应用门P分别对C-F-P-Y-F-P和fret滤光片的两个或三个不同直方图进行补偿。将30 µL细胞系一的悬液加入200 µL细胞系二的悬液中。然后点击仪器设置图标，接着点击补偿标签页并勾选矩阵，以打开补偿表。

通过变量图生成FRET面积与CFP面积的关系图，并应用门控P2。然后在细胞系1和细胞系2运行的情况下，点击象限图标，并绘制象限，使得荧光阴性和阳性群体由下方两个象限分隔。接着创建一个统计表，显示LL3和LR3门控中FRET的中位荧光强度（MFI），并调整补偿矩阵中的FRET参数，直到LL3与LR3之间的FRET信号MFI大致相等。

接下来，绘制YFP面积与CFP面积的双变量散点图，并划分四个象限。调整补偿矩阵中的YFP参数，直至各象限中YFP信号的平均荧光强度（MFI）大致相等，类似于此前FRET流式细胞术中所示结果。

主要的荧光溢出来源于CFP发射至FRET检测通道的信号，可通过使用单色阳性对照细胞进行荧光补偿来校正。当所有门均已设置且CFP信号已完成补偿后，标记出感兴趣的孔，并运行剩余孔以分析数据。首先，使用与建立流式分析时相同的参数定义细胞和单细胞群体。

接下来，使用细胞系三，将YFP单阳性细胞绘制到以FRET为纵坐标、YFP为横坐标的变异图中。绘制一个多边形门，沿FRET阳性细胞群的斜率方向并远离该斜率，以定义一个假FRET门，从而排除YFP信号渗漏至FRET滤光片的影响。将该假FRET门应用于所有样本后，将经空脂质体处理的C-F-P-Y-F-P细胞绘制到以FRET为纵坐标、CFP为横坐标的变异图中，并沿细胞群斜率方向绘制一个多边形门，使其向上且向左延伸，远离该细胞群。

所有进入该门控的事件均被视为FRET阳性，其细胞百分比与处理过程中使用的种子滴度相关。最后，记录分析中的相关参数，包括FRET阳性细胞百分比及其阳性细胞的中位荧光强度。随后，通过将阳性百分比与MFI相乘，手动计算整合的FRET密度。

在不存在 Tau 聚集体或种子的情况下，Tau 以可溶性单体状态存在，表现为持续的弥散性且 FRET 阴性的荧光信号。将 Tau 种子引入生物传感器细胞后，内源性 Tau 转变为聚集状态并呈现 FRET 阳性信号，可通过 FRET 定量检测。流式细胞术分析证实，飞摩尔浓度的重组 Tau 即足以被检测到。此处。

在不同年龄处死的tau蛋白病小鼠的脑干组织作为代表性脑区，显示出在动物中最早从1.5个月龄起即可稳定检测到种子活性。在本实验中，阿尔茨海默病患者的脑匀浆表现出强烈的种子活性，而年龄匹配的对照组以及亨廷顿病患者的脑组织则未表现出对tau聚集体的检测特异性。经转导表达tau-CFP和tau-YFP的慢病毒载体的原代神经元培养物，在接受重组tau种子处理后，呈现出弥散性的荧光信号。

然而，即使在没有脂质体介导转导的情况下，内源性 tau 也能形成可通过 FRET 流式细胞术检测到的大型聚集体。当种子来源预先与肝素等抑制 tau 摄取的药物共同孵育，并在无脂质体存在的情况下进行处理时，重组体 fis 和 tau 蛋白病小鼠脑样本中的种子活性均可被阻断。一旦掌握该技术。

该技术可在三天内完成，每天仅需一到两个小时的实验操作。在进行此操作时，需要注意某些步骤需要根据实验室的具体条件进行优化。例如，在测定来自不同生物来源的原型致病性种子的有效滴度时。

观看本视频后，您应能充分掌握如何设置、运行和分析基于 FRET 的流式细胞术实验，以检测来自重组和生物来源的蛋白病理性种子活性。