박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

이 절차의 전반적인 목표는 폴리스티렌 비드에 결합된 순수한 재조합 접착력으로 구성된 생체 모방 재료를 생산하는 것이며, 이를 사용하여 개별 박테리아 접착력과 숙주 세포 수용체 사이의 생화학적 및 기능적 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 이 방법은 숙주 세포 신호 전달에 미치는 영향 측정 및 병원체 매개 세포 독성 억제와 같은 숙주 병원체 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정제 된 접착력, AEA가 박테리아와 크기가 비슷한 고분자 입자에 방향성 및 공유 결합되어 박테리아 표면 표시를 모방한다는 것입니다.

저와 함께 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 TU A-C-E-D-A 박사 과정 학생입니다. 여기에서 탈 아민 방향성 결합을 시연할 것입니다. 이 프로토콜은 p, meli phenyl butyrate의 경우 SUL 숙시닐 또는 가교제인 SMPB를 사용하여 cystine을 함유한 단백질을 아민 기능화된 고분자 비드에 결합하는 데 적합하며, 비드 활성화 절차를 시작하기 위해 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 사용 직전에 필요한 모든 시약을 준비합니다.

비드 현탁액을 부드럽게 반전시켜 혼합한 다음 필요한 양의 비드 현탁액을 멸균 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 1ml의 멸균 PBS pH 7.0을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 마이크로 원심분리기에서 원심분리하여 비드와 펠릿을 세척합니다. 거대한 피펫과 흉터로 스내트를 조심스럽게 제거합니다.

Reese는 1ml의 새 멸균 PBS에 비드 펠릿을 현탁시키고 세척 단계를 반복합니다. 비드 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 0.8밀리리터의 PBS에 새로 준비된 10밀리몰 SFO SMPB 200마이크로리터를 추가합니다.

최종 농도가 2밀리몰이 되도록 하려면 비드가 배양하는 동안 섭씨 25도에서 회전하는 바퀴에서 1시간 동안 비드 현탁액을 배양합니다. 활성화된 비드에 즉시 첨가할 수 있도록 다음 커플링 단계를 위해 단백질을 준비합니다. 단백질 농도를 확인하고 커플링 반응에 필요한 최종 농도로 조정합니다. 6.

단백질과 PBS의 마이크로몰과 1밀리리터의 부피는 일반적으로 단백질 감소에 사용됩니다. TEP 원액을 첨가하여 최종 농도를 5밀리몰로 만듭니다. 용액을 30분 동안 배양합니다.실온에서 초기 단백질 농도를 결정하고 결합 효율을 계산하기 위해 몇 마이크로리터의 단백질 용액을 유지합니다.

활성화된 비드를 펠릿화하고 펠릿을 세척하여 단백질 결합 절차를 시작합니다. 신선하고 멸균된 PBS 1밀리리터에 펠릿을 준비된 단백질 용액에 다시 현탁시켜 원하는 단백질 농도를 제공합니다. 단백질 비드 현탁액을 섭씨 25도에서 2시간 동안 회전하는 바퀴에서 배양합니다.2시간 후, 최종 농도인 50밀리몰에 시스티나 스톡 용액을 첨가하고 회전하는 바퀴에서 섭씨 25도에서 30분 동안 현탁액으로 배양하여 비드의 나머지 활성화된 그룹을 비활성화합니다.

원심분리로 구슬을 잡았습니다. 단백질 농도를 측정하고 결합 효율을 계산하기 위해 snat를 유지하십시오. PBS의 1 밀리리터로 구슬 펠릿을 두번 세척하고 새로운 PBS의 1 밀리리터와 1 밀리리터의 신선한 PBS를 경쟁 분석실험 씨 150의 농도에 hela 세포의 1 밀리리터를 가진 24 웰 판의 각 우물을 주기 위하여 150, 밀리리터 당 000의 세포를 세척하십시오.

이를 통해 세포는 실험을 시작하기 전에 약 80%co 유창성에 도달할 수 있습니다. 5밀리리터의 해양 LB 배양물에 V para 용혈성의 신선한 군체를 접종하고 하룻밤 동안 섭씨 30도에서 흔들면서 성장합니다. 앞서 설명한 바와 같이 충분한 bead coupled multivalent adhesion molecule을 준비합니다.

웰당 100 x 비드 스톡의 100 마이크로리터 또는 대회 분석 당일에 500 나노몰 단백질의 최종 농도를 허용합니다. 박테리아 배양의 OD 600을 측정합니다. 첨가제 없이 박테리아 배양액을 무색 DMM으로 희석하여 감염 배지를 준비합니다.

섭씨 37도로 예열하고 10%의 부피를 부피로 끌어올리면 현탁액이 이깁니다. MOI가 10이 되려면 웰당 1밀리리터를 준비하고 샘플당 10-20%의 초과 부피를 준비합니다. 우물에서 오래된 매체를 제거하고 배양 된 것을 씻으십시오.

각 웰에 1ml의 멸균 PBS를 섭씨 37도로 예열하여 세포를 치료합니다. PBS를 제거하고 웰당 1ml의 감염 배지를 추가합니다. 대조군 비드와 박테리아를 양성 대조군으로, 접착 비드를 포함하는 용액을 추가하고 박테리아가 없는 용액을 음성으로 추가합니다. 컨트롤.

0.1%TRITTON X 100을 포함하는 DMM을 lysis control로 추가합니다. 대조군을 세 번 포함한 각 실험 조건을 설정합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 섭씨 37도의 플레이트를 배양합니다.

세포 독성을 평가합니다. 감염 후 4시간 후. 24웰 플레이트에 사용된 각 웰에서 200마이크로리터를 제거하고 새 96웰 플레이트로 옮깁니다.

96웰 플레이트를 1, 500G에서 5분 동안 회전시키고 각 웰에서 100마이크로리터를 새 96웰 플레이트로 옮깁니다. 감염 실험에 사용된 배지 100마이크로리터를 블랭크로 사용할 96웰 플레이트의 새 웰 3개에 추가합니다. LDH 세포독성 검출 키트를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 젖산 탈수소효소 방출 분석을 수행합니다.

먼저 필요한 시약의 양을 25씩 계산합니다. 예를 들어 샘플이 100개인 경우입니다. 11.25 밀리리터의 시약 A와 250 마이크로 리터의 시약 B를 혼합하여 거품이 발생하지 않도록 반전시키고 소용돌이하지 마십시오.

다음으로 혼합물을 저장소에 넣으십시오. 그런 다음 각 샘플에 100마이크로리터의 시약 혼합물을 추가하고 플레이트를 실온에서 10분, 20분 및 30분 동안 배양합니다. 플레이트 리더에서 490나노미터의 흡광도를 판독합니다.

그 후, 원고에 기술된 대로 세포독성 퍼센트를 계산하고, 박테리아 부착을 측정하고, 감염 1시간 후에 이루어진다. 세포층에서 배지를 제거하고 멸균 예열 PBS로 세포층을 철저히 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. PBS의 1 밀리리터로 적어도 3-4 번 세척하십시오.PBS의 멸균 1 % 부피 트리톤 X 100 용액 1 밀리리터를 각 웰에 첨가하여 숙주 세포에 용해 할 때마다 플레이트를 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양합니다.

각 웰의 내용물을 각각 분리하기 전에 각 샘플을 여러 번 위아래로 피펫팅합니다. 1.5 밀리리터 튜브. 시료를 10배 연속 희석하여 멸균 PBS 플레이트에 넣고, 각 시료를 100마이크로리터씩 해양 LB 한천에 주입하고, 세포 스프레더를 사용하여 박테리아 균주 및 이 실험 설정의 시점에 따라 플레이트에 사용할 희석액을 최적화합니다.

10에서 5배 또는 10에서 6배 희석하면 적절한 수의 CFU가 제공됩니다. 다음 날 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하고 식민지 계수로 박테리아를 열거합니다. 경쟁 분석에서, 발뒤꿈치 세포는 V para 용혈 균주에 감염되었다.

불량한 것은 양성으로 표시되거나 다른 경쟁 개체가 있는 곳에서 감염되지 않은 상태로 남아 있습니다. 불량한 1에 의한 시험관 내 감염은 매우 높은 수준의 세포 용해를 초래했으며, 이는 MAM 7 결합 비드에 의해 억제되었지만 MA'AM 1 결합 또는 GST 결합 비드에 의해 억제되지 않았습니다. 처리되지 않은 HELOC 세포 또는 MAM으로 배양된 세포에 부착된 v 마비의 계수.

7 개의 MAM 1 또는 GST 제어 비드가 MAM을 밝혔습니다. 7개의 비드가 있지만 MAM 1 또는 GST 제어 비드는 없습니다. 숙주 세포 표면 수용체에 부착하기 위한 용혈성 대 용혈성 능가.

플루오로에 결합된 접착력. 4개의 Labeled bead는 숙주 세포에 대한 박테리아 부착을 모방할 수 있으며 세포 이미징을 위한 강력한 도구입니다. 오른쪽의 튜브에는 형광 파란색 생체 모방 구슬의 현탁액이 포함되어 있습니다. 맘.

상피 세포에 대한 MAM 7 매개 부착 과정을 특성화하기 위해 7개의 결합된 형광 파란색 구슬을 사용했습니다. MAM seven을 숙주 세포에 부착하면 액틴 재배열 및 응력 섬유 형성이 이루어졌으며, 이는 Rumine Phin을 사용하여 f actin을 염색하기 위해 공동 시각화되었습니다. 이 절차에 따라 단백질체학 또는 웨스턴 블롯과 결합된 친화성 정제와 같은 다른 방법을 수행하여 박테리아 부착의 다운스트림 신호 전달 과정에 관여하는 숙주 세포 인자와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.