동맥 경화의 빠른 검색을위한 산화철 나노 입자의 전자 레인지 중심의 합성

본 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 모델에서 죽상동맥경화증의 신속한 MRI 검출을 위해, 마이크로파 기술을 이용하여 비스포스포네이트(bisphosphonate) 작용기가 결합된 산화철 나노입자를 빠르게 합성하고 기능화하는 것입니다. 산화철 나노입자의 합성 및 기능화에 마이크로파 기술을 적용하는 사례는 여전히 제한적입니다. 그러나 본 연구에서는 고품질의 나노입자를 제조하고 극도로 신속한 프로토콜을 개발하는 방법을 제시합니다.

이 기술의 주요 장점은 매우 짧은 시간 내에 고품질의 기능화된 나노입자를 제조할 수 있으며, 이를 미세석회화를 표적으로 하는 죽상동맥경화반의 카테터 삽입에 사용할 수 있다는 점입니다. 이 절차를 시작하려면, 마이크로파 전용 플라스크에 iron 3-acetylacetenate 0.5 g, oleic acid 1.4 mL, oleylamine 0.6 mL, 1, 2-Hexadodecanediol 1.19 g을 넣습니다. 눈금 피펫을 사용하여 phenyl ether 10 mL를 플라스크 벽면을 따라 조심스럽게 첨가합니다.

그 다음, 플라스크를 마이크로웨이브 반응기에 넣고 마이크로웨이브에 동적 연구(dynamic study) 설정을 로드하여 마이크로웨이브 프로토콜을 시작합니다. 반응이 완료되고 플라스크가 실온으로 냉각되면, 유리 피펫을 사용하여 반응 혼합물을 삼각 플라스크로 옮기고 98% 에탄올 10 milliliters를 첨가합니다. 플라스크를 네오디뮴 니오븀 붕소 자석 위에 올리고 5분 후에 유리 피펫으로 상층액을 제거합니다.

다음으로, 플라스크에 ethanol 10 milliliters를 추가합니다. 실온에서 40 kilohertz로 2분 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 처리가 끝나면 샘플을 자석 위에 놓은 뒤 상층액을 제거합니다.

올레산(oleic acid)으로 코팅된 나노입자를 30 milliliters의 클로로포름(chloroform)에 분산시키고, 상온에서 40 kilohertz로 5분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, 나노입자 0.5 milliliters를 유리 큐벳으로 옮기고 클로로포름 0.5 milliliters를 추가합니다. 제조사의 지침에 따라 zetasizer로 유체역학적 크기를 확인합니다.

이 단계에서, 과망가니즈산 칼륨 44.3 milligrams와 벤조일 트리메틸 암모늄 클로라이드 150.4 milligrams를 물과 클로로포름의 3:2 혼합액에 녹입니다. 생성된 용액을 마이크로파 전용 플라스크에 담긴 올레산 코팅 나노입자 5 milliliter Aliquat에 추가합니다. 온도를 105 °C, 시간을 9분, 압력을 250 psi, 전력을 300 watts로 설정하여 아젤라산 나노입자를 위한 마이크로파 프로토콜을 시작합니다.

그 다음, 플라스크에 pH 2.9 인산염 완충액 10 milliliters를 추가합니다. 마이크로웨이브 프로토콜을 반복하고 상층액을 제거한 후, 플라스크에 물 10 milliliters를 추가하고 혼합물을 삼각 플라스크로 옮깁니다. 가장 중요한 단계는 아젤라산 나노입자의 정제 과정입니다.

다음으로, 10% sodium bisulphate 5 milliliters를 삼각 플라스크에 넣고 25 °C에서 40 kHz로 2분 동안 초음파 처리합니다. 입자를 수집하고 상층액을 제거한 후, 1% sodium hydroxide로 나노입자를 3회 더 세척합니다. 입자를 pH 7.2 phosphate buffer 5 milliliters에 재분산시킵니다.

수력학적 크기와 제타 전위를 확인하려면, 아젤라산 나노입자 0.7 milliliters를 일회용 폴디드 모세관 셀(folded capillary cell)로 옮긴 후 분석을 위해 제타사이저(zetasizer)에 넣습니다. 원심분리 튜브에 아젤라산 나노입자 Aliquat 2 milliliter와 함께 EDC 12 milligrams 및 sulfo-NHS 15 milligrams를 첨가합니다. 혼합물을 실온에서 35분 동안 볼텍싱(vortex)합니다.

원심분리 튜브 아래에 자석을 배치하여 나노입자를 불안정하게 만든 후, 상층액을 흡입 제거하고 1 mM HEPES 완충액 1.5 mL로 입자를 세척합니다. 그다음, neridronate 5 mg을 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 볼텍싱합니다. 자석을 이용하여 나노입자를 분리하고 1 mM HEPES 완충액으로 세척합니다.

마지막으로, 네리드로네이트 나노입자를 2 milliliters의 1 millimolar hepes buffer에 분산시킵니다. 유체역학적 크기와 제타 전위를 확인하기 위해, 네리드로네이트 나노입자 0.7 milliliters를 일회용 폴디드 모세관 셀(folded capillary cell)에 넣고 zetsizer에 배치하여 분석합니다. 모든 나노입자는 매우 좁은 크기 분포 내에서 작은 유체역학적 크기를 나타냈습니다.

TEM 이미지에서 알 수 있듯이 입자들은 우수한 결정성을 나타냅니다. 또한, 합성을 4회 반복한 후에도 수력학적 크기와 분포에 대해 동일한 결과가 얻어졌으며, 이는 마이크로파 방식의 가장 중요한 특징 중 하나인 재현성을 입증합니다. 네리드로네이트 나노입자에 포함된 비스포스포네이트로 인한 칼슘 이온 결합 특성을 릴랙소메트리로 확인한 결과, 칼슘 이온이 없는 나노입자는 안정적으로 유지된 반면, 칼슘 이온이 있는 경우에는 나노입자 클러스터가 형성되어 T2 이완 시간이 칼슘 이온의 양과 배양 시간에 따라 선형적으로 증가함을 확인하였습니다.

48주령의 apoe 녹아웃 마우스를 대상으로 in vivo MRI 실험을 수행하였으며, 주사 1시간 후 플라크의 신호는 기저 영상과 비교하여 저신호 강도를 나타냈습니다. 또한, 플라크 대 근육 비율은 기저 영상과 주사 1시간 후 영상 사이에 유의미한 차이가 있었습니다. neridronate 나노입자 주사 후 간의 신호 또한 모니터링하였으며, 해당 나노입자가 20분 후 혈류에서 완전히 제거된 것을 확인하여 죽상경화성 플라크에 대한 이 나노입자의 선택적 축적을 입증하였습니다.

Ex vivo 영상 촬영 및 조직학적 분석을 수행하였으며, 나노입자가 포함된 대동맥과 포함되지 않은 대동맥의 영상을 통해 in vivo 실험 결과와 일치하는 신호 강도의 차이를 확인하였습니다. 마이크로웨이브 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 합성, 특성 분석 및 플라크 검출까지 총 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 약간의 수정만으로 열화상 촬영과 같은 다른 영상 기술을 적용할 수 있어, 죽상동맥경화증의 정량화와 같은 추가적인 질문에 답할 수 있다는 점입니다.

이 기술의 개발 이후, 심혈관 영상 분야의 연구자들은 임상적 요구에 쉽게 맞출 수 있는 실험적 설정을 통해 죽상동맥경화증의 조기 진단 가능성을 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 마이크로파를 이용하여 친수성 산화철 나노입자를 제조하는 방법과 이를 심혈관 영상에 응용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 사용하는 오븐에 따라 마이크로파 오븐 작업이 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 시스턴의 압력 조절과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.