סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים את הסינתזה של ליפוזומים המגיבים לאור ולחשוף את המנגנון לשחרור תרופות מבוקרות אור מהליפוזומים הללו. שיטה זו עוזרת לענות על שאלות המפתח בתגובת אור פיגורטיבית של ליפוזומים למתן תרופות, כאשר האתגרים העיקריים הם לסנתז את הליפוזומים ולהגביר את המגנזיום בשחרור מבוקר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא סינתזת תאים של ליפוזומים מגיבים לאור עם החומרים הזמינים מסחרית.

ההשלכה של טכנולוגיה זו משתרעת על הטיפול השטחי ברקמות. השימוש בפרוצדורות התחמקות מינימליות כמו גם חלק ממכשיר הלייזר, יהפוך את הפלטפורמה הטכנולוגית לנגישה יותר למטופלים. מלבד מתן תובנות לגבי הטיפול הטוב ביותר ואספקת תרופות מדויקת, ניתן ליישם את המערכת שלנו גם על מערכות אחרות כגון אני-מה-מו-רוז קטן כמו גם מערכת ריר באמצעות לייזרים מונחים.

ראשית נקו בקבוק תחתון עגול בנפח 100 מיליליטר באמצעות אקווה רג'יה. לאחר שטיפה במים נטולי יונים וחיטוי, יבשו את הבקבוק בתנור אוויר חם בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן עוטפים ומאחסנים את הבקבוק הסטרילי עד לשימוש.

עקר סט מיני מכבש ידני באמצעות 70% אתנול. לאחר מכן, הפעל את המאייד הסיבובי והגדר את הטמפרטורה של אמבט המים החמים ומגדל הקירור ל -37 ו -4 מעלות צלזיוס, בהתאמה. הכן תמיסת מלאי סידן של 60 מילי-מולרית על ידי המסת 374 מיליגרם של קלצין ו-10 מיליליטר של 0.1 מילי-מולרי פוספט חוצץ מלח או PBS.

התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות תמיסת נתרן הידרוקסיד מולרית אחת. מוציאים את השומנים מהמקפיא ומפשירים אותם לטמפרטורת החדר. לאחר הפשרת השומנים ממיסים 15.9 מיליגרם DPPC, 1.3 מיליגרם MPPC ו-2.8 מיליגרם DSPE-PEG2000 ושני מיליליטר כלורופורם.

לאחר העברת תמיסת הכלורופורם לבקבוק תחתון עגול סטרילי, מאדים את הממס באמצעות המאייד הסיבובי בלחץ מופחת ליצירת שכבת שומנים יבשה דקה. לאחר מכן, יש להרטיב את שכבת השומנים ב-45 מעלות צלזיוס עם שני מיליליטר של תמיסה מימית המכילה 1.95 מיליליטר מתמיסת הסידן של 60 מילי-מולרית שהוכנה בעבר ו-50 מיקרוליטר של ננו-חלקיקי זהב למשך 30 דקות. מחממים מראש גוש חימום ל 45 מעלות צלזיוס.

הנח מסנן ממברנה פוליקרבונט 200 ננומטר בין תומכי המסננים והרכיב את סט המכבש המיני. לאחר מכן בדוק אם יש דליפה פוטנציאלית עם מים נטולי יונים. מלאו את אחד המזרקים במיליליטר אחד מתמיסת הליפוזום שהוכנה בעבר והוציא את הדגימה על ידי העברת התמיסה דרך המזרק בקצה השני של מכבש המיני המורכב.

לאחר חזרה על השלב הקודם 11 פעמים, העבירו את הליפוזומים המסונתזים דרך עמודת התפלה PD-10 כדי להסיר את חלקיקי הזהב החופשיים, השומנים והקלצאין, תוך שימוש ב-PBS כחומר הניקוי על פי פרוטוקול היצרנים. בסיום, אחסן את הדגימות בצינורות סטריליים בארבע מעלות צלזיוס. בשלב זה, חשב את המולריות השומניות של תמיסת המלאי על ידי הוספת המולריות של DPPC, MPPC ו-DSPE-PEG2000.

יש לדלל את תמיסת מלאי הליפוזום לריכוז שומנים של 5 מילי-מולרי באמצעות PBS של 0.1 מילי-מולרי, ולאחר מכן להעביר את הדגימות לצינורות צנטריפוגה של 2 מיליליטר. לאחר מכן, הניחו את הצינורות באמבט מים חמים והעלו את הטמפרטורה בהדרגה בין 25 ל -70 מעלות צלזיוס. אסוף 10 מיקרוליטר בנקודות טמפרטורה שונות.

ב-10 מיקרוליטר של שני אחוז טריטון x-100 ל-2 מיליליטר של תמיסה ליפוזומלית לעיכול הליפוזומים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשגת שחרור מלא של קלצאין. לאחר מכן, העבירו 200 מיקרוליטר של התמיסה הליפוזומלית לכל באר במיקרופלטה של 96 בארות. מדוד את עוצמת הקרינה של הדגימות שנאספו באמצעות קורא מיקרו לוחות פלואורסצנטי.

אם ניקח את עוצמת הקרינה של הדגימות המטופלות בטריטון x-100 כשחרור של 100 אחוז, חשב את אחוז הקלצין המשוחרר בכל נקודת זמן באמצעות הנוסחה הבאה: העבירו 100 מיקרוליטר מתמיסת הליפוזום לקובט קוורץ והניחו את הקובט במחזיק קובטה. הנח את קרן הלייזר הקולימציה דרך הקובט כך שהאור יעבור דרך תמיסת הליפוזמה. לאחר מכן אסוף אליקוטים לאחר פולסים שונים.

לאחר מכן יש להוסיף 10 מיקרוליטר של 2% טריטון x-100, ל-2 מיליליטר של תמיסה ליפוזומלית כדי לעכל את הליפוזומים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשיג שחרור מלא של קלצין. כדי למדוד מראש את השפעת ההלבנה של הלייזר על תמיסת Calcein חשוף את התמיסה ללייזר פוסט בתדר של 1 הרץ עבור מספרי פולסים משתנים. למדוד את עוצמת הקרינה של Calcein באורכי גל עירור ופליטה של 480 ו-515 ננומטר בהתאמה לפני ואחרי החשיפה ללייזר.

לאחר חישוב כמויות ההלבנה, השתמש בגורם זה כדי לנרמל את הערכים המתקבלים מדגימות ליפוזומים על ידי הכפלת עוצמת הקרינה של הליפוזומים עם הגורם. לאחר מכן, מדוד את עוצמת הקרינה של הדגימה שנאספה באמצעות קורא מיקרו לוחות פלואורסצנטי באורכי גל עירור ופליטה של 480 ו-515 ננומטר בהתאמה. אם ניקח את עוצמת הקרינה של הדגימות שטופלו בטריטון x-100 כשחרור של 100 אחוז, חשב את אחוז הקלצין המשוחרר בכל מספר פולס.

הנח 100 מיקרוליטר מהדגימה על שקופית מיקרוסקופ ולאחר מכן הגדר את מוקד הלייזר על הדגימה. הלייזר מונחה דרך הדגימה באופן ידני ולכן חשוב לוודא שנקודת המוקד של הקרן נמצאת היטב בתוך הדגימה ולא בשקופית המיקרוסקופית כדי למנוע ניסויים מאוחר יותר. לאחר מכן טבלו הידרופון מחט בתמיסה.

קצה ההידרופון יוצא לתוך הדגימה במרחק מספיק מנקודת המוקד של הלייזר. זה נעשה כדי למנוע נזקים הנגרמים על ידי לייזר עם ההידרופון. הקרין את הדגימה בלייזר הדופק עם מספרי פולסים ואנרגיית דופק משתנים.

לבסוף הקלט את אותות הלחץ באמצעות אוסצילוסקופ דיגיטלי. לא נצפה הבדל משמעותי באחוז השחרור עבור ליפוזומים עם ובלי ננו-חלקיקי זהב. הליפוזומים היו כמעט שלמים בטמפרטורה פיזיולוגית עם אחוז דליפה של פחות מ-10 אחוזים עם או בלי ננו-חלקיקי זהב.

כאשר הטמפרטורה הועלתה ל-42 מעלות צלזיוס, 60 עד 80 אחוז מהקלצין העטוף השתחרר מהליפוזומים תוך שתי דקות. ליפוזומים עם ננו-חלקיקי זהב שחררו את הקלצין המכוסה בעירור שבו כמות הקלצאין המשוחררת גדלה ככל שמספר הפולסים גדל. האותות האקוסטיים שנרשמו עבור ננו-חלקיקי הזהב, הליפוזומים עם ננו-חלקיקי זהב והליפוזומים ללא ננו-חלקיקי זהב מוצגים כאן:דחף הלחץ, מכיל פאזות חיוביות ושליליות כאחד ומצביע על כך שמיקרו-בועות נוצרות ומשבשות בתמיסה.

כצפוי, משרעת האות האקוסטי גדלה בהדרגה עם אנרגיית הלייזר הגוברת וצריכה לנבוע מעוצמת התנודה המוגברת של החלקיקים המיוחסת להתרחבות והתכווצות התרמו-אלסטית שלאחר מכן. לאחר השליטה בייצור הליפוזומים ניתן לבצע תוך 3 שעות בתנאי שכל כלי הזכוכית והציוד מוכנים מראש. בעת ניסיון השחרור המבוקר בלייזר חשוב לזכור שקרן הלייזר ממוקדת לחלוטין לדגימה כדי למנוע אובדן אנרגיית לייזר.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע ניסויים אחרים כמו שחרור מבוקר במבחנה ובלייזר ויול כדי לענות על שאלות נוספות כמו כיצד התנאים הפיזיולוגיים ישפיעו על השחרור המבוקר בלייזר. לאחר פיתוח זה, טכניקה זו תהיה בעלת תושייה בתחום התגובתיות כדי לחקור, למקם ולשלוט בשחרור לעור, לעיניים ולקרום הרירי.