Получение Крыса олигодендроцитов предшественники культур и Количественная оценка Oligodendrogenesis Использование двойного инфракрасного флуоресцентного Сканирование

Общая цель данной процедуры заключается в выделении и культивировании клеток-предшественников олигодендроцитов крысы, а также в количественной оценке олигодендрогенеза в ответ на экспериментальные факторы. Эффективный олигодендрогенез является терапевтической целью во многих областях исследований, включая повреждения спинного мозга, неонатальную гипоксию и демиелинизирующие заболевания, такие как поперечный миелит и рассеянный склероз. Основным преимуществом данной методики является сочетание протокола выделения большого количества OPC с быстрым и надежным методом определения олигодендрогенеза одновременно для нескольких экспериментальных условий.

Для начала данной процедуры простерилизуйте все инструменты для диссекции с помощью нагревательного стерилизатора с шариками. Затем добавьте от 15 до 20 мл PBS в коническую пробирку объемом 50 мл. Поместите коническую пробирку на лед и используйте ее для размещения измельченной ткани коры во время диссекции.

Затем добавьте холодный PBS в чашку Петри диаметром 10 сантиметров, которая будет использоваться для диссекции под световым микроскопом. После забивания крысят с помощью маленьких ножниц сделайте разрез кожи за ушами по срединной линии. Затем отгните кожные лоскуты назад.

Затем сделайте разрез черепа по срединной линии от ствола мозга к глазам. Будьте осторожны, чтобы не прорезать слишком глубоко, чтобы сохранить структуру подлежащей коры. После этого сделайте два латеральных разреза ниже мозжечка, введя маленькие хирургические ножницы в большое затылочное отверстие.

Сделайте дополнительный разрез между глазами спереди от обонятельных луковиц. Осторожно отгните каждую половину черепа назад. Извлеките весь головной мозг и поместите его в чашку Петри диаметром 10 сантиметров, заполненную холодным PBS.

Под препарирующим световым микроскопом удалите обонятельные луковицы и мозжечок с помощью тонкого хирургического пинцета. Переверните мозг так, чтобы была видна вентральная поверхность. Затем, используя тонкий прямой пинцет, проведите тупую диссекцию, вводя сомкнутые кончики пинцета между корой и гипоталамусом на глубину примерно двух третей мозга.

Раскройте пинцет, когда он будет установлен, затем повторите процедуру для другого полушария. После этого аккуратно отделите кору от областей гипоталамуса и среднего мозга. Удалите гипоталамус, таламус и средний мозг, удерживая средний мозг за его заднюю поверхность и отделяя его в направлении переднего конца головного мозга.

Затем перережьте передние связи. Используя тонкий изогнутый диссекционный пинцет, удалите гиппокамп, перерезав его связь с корой. После этого удалите оставшуюся часть стриатума, соскребая её с подлежащей коры диагональными движениями от центра к периферии.

Очистите вентральную поверхность коры от кровеносных сосудов и мозговых оболочек. Затем переверните мозг так, чтобы была видна дорсальная поверхность. Отделите мозговые оболочки от подлежащей коры в области расположения обонятельной луковицы.

Повторите эти процедуры для трех-четырех крысят. Поместите все препарированные фрагменты коры в чашку Петри. Измельчите их стерильным лезвием до получения кусочков размером 1 мм на 1 мм.

Затем соберите ткани, промыв чашку PBS, после чего снова поместите ее на лед. Теперь, используя стеклянную пипетку Пастера, подключенную к контроллеру пипеток, механически диссоциируйте ткань путем пипетирования от десяти до пятнадцати раз или до тех пор, пока фрагменты ткани не уменьшатся в размере, а раствор не станет мутным. Затем верните образец в инкубатор для культур тканей при 37 °C на 15 минут при непрерывном вращении.

После этого добавьте по 10 миллилитров PBS в каждый образец и профильтруйте гомогенат через фильтр с размером пор 40 микрометров, помещенный над пробиркой объемом 50 миллилитров. Затем промойте фильтр дополнительными один-два миллилитрами PBS. Объедините все образцы гомогената в одной конической пробирке объемом 50 миллилитров и определите общее количество клеток.

После подсчета клеток равномерно разлейте гомогенат по коническим пробиркам объемом 15 мл и центрифугируйте их в течение 10–12 минут при 300 gs. Подготовьте каждую колонку LS, добавив пять миллилитров буфера для колонки. Соберите фильтрат в коническую пробирку объемом 15 мл.

После того как буфер для колонки полностью пройдет через верхнюю камеру, нанесите по 1000 µl клеточной суспензии в каждую колонку и дайте клеткам пройти через нее под действием силы тяжести. Затем извлеките каждую колонку и поместите ее в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте 5 мл буфера для колонки и быстро пропустите буфер через колонку, чтобы вытеснить связавшиеся клетки и высвободить их из колонки.

Для посева клеток разведите их в среде для пролиферации OPC до концентрации 60 000 клеток на миллилитр. Пипеткой внесите 500 мкл клеточной суспензии вдоль стенки каждой лунки 24-луночного черного планшета с прозрачным дном. Перемешайте клетки, встряхивая планшет горизонтально восьмерообразными движениями.

При выполнении данной процедуры наденьте наконечник дозатора объемом 200 µL на стеклянную пипетку Пастера, чтобы предотвратить повреждение лунки при аспирации. Затем аспирируйте среду из лунок с культурами, обрабатывая по одной группе за раз, чтобы избежать высыхания клеток. После этого медленно добавьте 500 µL мастер-смеси для обработки по стенке лунки, используя дозатор объемом 1 mL.

Инкубируйте культуры и каждые два-три дня проводите полную замену среды на свежую среду для обработки. По истечении желаемого периода обработки аспирируйте среду. Медленно добавьте 400 µL PFA по стенке лунки для фиксации клеток.

Инкубируйте планшет в течение 20 минут при комнатной температуре. Через 20 минут аспирируйте PFA и медленно добавьте 500 µL стерильного D-PBS для промывки клеток. Повторите промывку еще два раза; финальный раствор для промывки не аспирируйте.

Теперь доведите планшет до комнатной температуры, аспирируйте содержимое лунок и добавьте 250 µL D-PBS, содержащего 5% NGS и 0,1% Triton x-100. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа при осторожном орбитальном встряхивании. Приготовьте раствор для первичной инкубации, разводя моноклональные мышиные антитела к MBP и поликлональные кроличьи антитела к olig2 в D-PBS, содержащем 5% NGS.

Затем инкубируйте первичные антитела при температуре four degrees Celsius в течение ночи (от 16 до 18 часов) при осторожном орбитальном встряхивании. Во время промывки планшета приготовьте раствор для вторичной инкубации, разведя антитела anti mouse 680 и anti rabbit 800 в D-PBS, содержащем five percent NGS. Далее аспирируйте последнюю порцию промывочного раствора и добавьте 250 microliters раствора для вторичной инкубации.

Защитите планшет от света и инкубируйте его при комнатной температуре в течение одного часа при осторожном орбитальном перемешивании. После этого просканируйте планшет с помощью системы визуализации, способной регистрировать флуоресцентное излучение на длинах волн 700 нм и 800 нм. В качестве начальных настроек установите смещение фокуса на 3, а чувствительность на 1,5 для MBP, 5,0 для actin и 3,5 для olig2.

Отрегулируйте значения чувствительности по мере необходимости, чтобы избежать переэкспозиции сигнала. На данной схеме анализ DIFS начинается с تازهвыделенных A2B5-положительных OPC крыс, высеянных в культуральные сосуды с покрытием из PLL. Эти культуры размножают в течение трех дней в присутствии 20 ng/mL PDGFAA, а затем, в день ноль, обрабатывают экспериментальными факторами в свежей среде без PDGF.

На второй день среда для обработки полностью заменяется. На четвертый день клетки фиксируют 4% параформальдегидом. Здесь на нулевой и четвертый дни для репрезентативных культур была проведена иммуноцитохимия на olig2 и MBP с использованием Dapi в качестве ядерного контрастного красителя.

В этих культурах на нулевой и четвертый дни наблюдается конститутивное окрашивание на pan-маркер клеток олигодендроцитарной линии Olig2. В то же время окрашивание на маркер зрелых олигодендроцитов MBP стало заметным только к четвертому дню. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как очищать, культивировать и дифференцировать A2B5-положительные OPC крыс для количественной оценки влияния экспериментальных факторов на олигодендрогенез.

Идентификация факторов, стимулирующих олигоденрогенез, имеет особое значение для изучения демиелинизирующих заболеваний, таких как рассеянный склероз. Овладение описанными здесь методами может помочь в выявлении таких факторов и, в конечном счете, в разработке более эффективных терапевтических средств.