Name: マウスの冠動脈内皮細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学ぶマウス冠動脈内皮細胞の単離法。CD31バッファーとIGGビーズを用いて高純度・高収量の細胞を取得し、心血管研究のイメージングや分子生物学実験に応用できます。

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この作品は、国立衛生研究所（A.牧野へHL115578）からの助成金によってサポートされていました。

マウスでの研究は、アリゾナ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従って行きました。 注：セクション1、2および3は、セットアップとして、実験の前日に行われるべきです。 1.準備ソリューション<ol><li> CD31バッファー（50ml）で<ol><li> 50ミリリットルチューブに50ミリリットルの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。 0.05 gでウシ血清アルブミン（BSA）および0.037 gでエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を秤量し、50mlチューブに追加し、粉末が溶解するまで約1時間回転するチューブを置きます。 、pHを7.4に調整し、新しい50ミリリットルチューブに0.2μmのフィルターでろ過し、使用するまで4℃で保存してください。 </li></ol></li><li> HEPESを有するハンクス平衡塩溶液（HBSS）（500mL）で<ol><li> HBSS溶液に10mMのHEPESを作り、よく混合するHEPESの1.1915グラムを追加します。 pH値を測定し、7.4に調整します。 4におけるフィルタと店舗˚C。 </li></ol></li><li> 1×クレブス溶液（1 L） <ol><li> 1リットルのフラスコに蒸留水を倍増する10×クレブス液[ 表1]の100ミリリットルを追加します。 2.1グラム重炭酸ナトリウムおよび2グラムD-グルコースを計量し、フラスコに追加します。混合し、1 Lに全量を</li><li>フードの内側30分およびフィルタソリューションの95％O 2/5％CO 2ガスとバブルソリューション。 4℃で保存し、実験中氷上に保ちます。 </li></ol></li></ol> 2.磁気ビーズを準備<ol><li>各1.5mlチューブ（サンプルあたり1管）に1ミリリットルCD31バッファを追加します。ヒツジ抗ラットIgGビーズを混合し、各サンプル[ 表1]に適切な量を追加します。勢いよく30回チューブを振ると揺れの1分間磁石板に配置します。プレート上にしながら、チューブを開き、バケットにソリューションをダンプします。 </li><li>各チューブに1ミリリットルCD31バッファを追加します。 2μlのラット抗マウスCD31抗追加します4ºCでチューブO / Nを各チューブにボディと回転します。 </li></ol> 3.オートクレーブ<ol><li>すべての手術ツールやピペットチップをオートクレーブ。 4直径の異なるヒントがあるように狭いために、最も広いから、ピペットチップの先端をカットします。ヒントのためのおおよその直径はそれぞれ3ミリメートル、2.5ミリメートル、2ミリメートル、および1.5ミリメートルです。ヒントをカットし、121ºCの温度で殺菌の30分に前日オートクレーブ。 注：セクション4から11は、実験の日に行われるべきです。 </li></ol> 4.準備ソリューション<ol><li> M199で2％の鉄を強化した胎仔血清（IFCS）を含む洗浄バッファーを準備します。イメージングのために、30ミリリットル/マウスを準備します。 </li><li>酵素液（10ミリリットル/サンプル）を準備します。 50ミリリットルチューブに0.6単位/ディスパーゼのミリリットルおよび1mg /コラゲナーゼタイプIIのミリリットルを計量。 M199を追加し、15分間、4ºCでチューブを回転させます。 insid新しい50ミリリットルチューブに0.2μmのフィルターでろ過電子フード、使用するまで4℃に保ちます。 </li><li>ヘパリンでHBSS / HEPESを準備します。 15ミリリットルチューブに10 mMのHEPESをHBSSの10ミリリットルを追加します。チューブにヘパリンの100μlを添加して、使用するまで4℃に保ちます。 </li></ol> 5.ビーズを洗浄<ol><li> 4ºCで回転子からビーズとチューブを取り出し、フードにもたらします。磁性板にチューブを置き、1分間振ります。ソリューションをダンプし、各チューブに1ミリリットルCD31バッファを追加します。 </li><li>磁性板の外管を取り、激しく30回振ります。磁性板に管をバック入れて、合計3回の洗浄のために繰り返します。終了後、4℃に戻し管を入れ、使用するまで回転し続けます。 </li></ol> 6.解剖<ol><li>血液凝固を防止するためにヘパリンを0.1 mlをマウスの腹腔内に注入します。 10分待ってから、ペントバルビタールの0.01ミリリットルの腹腔内注射を使用して、マウスを麻酔。マウスが感じているかどうかを確認します足をつまんで痛み。 </li><li>頭を上にしてポリスチレンボード上にマウスを置き、ピンと腕を保持します。喉まで胸部上部の領域で皮膚をカットする鉗子とタフなカットはさみを使用してください。 </li><li>ちょうど横隔膜上記の胸郭の中央にカットしてください。心臓や肺を露出する三角形を作るために喉に向かって横向きや上向きに骨をカットします。ちょうど横隔膜の上行大動脈をカットします。 </li><li>引っ張らずにピンセットで胸腺を持ち、一緒に肺と心臓を除去するために慎重に任意の結合組織を切断するはさみを使用しています。 1×クレブスを入れたビーカーに入れ組織は、鉗子で振ると1×クレブスで6センチメートル皿に移します。 </li><li>ハサミやピンセットを用いて肺葉を削除します。大動脈に20 G滅菌カテーテルを挿入します。 HBSS /ヘパリンと冠状動脈循環系に血液をフラッシュします。心室の小さなカットを行い、M199のサンプルチューブに心臓や転送を振ります。氷の上にチューブを保管してください。 </li></ol><p<html>クラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 7。組織消化<ol><li>酵素液10mlを充填した6センチメートル皿に心を移し、はさみを使用して小片にそれをミンチ。 15分間、37ºCインキュベーターに皿を置きます。組織が容易に通過できるようにするために切断端と先端を通って下方に30回ピペッティングによって消化された材料を攪拌します。 </li><li>さらに15分間37ºCインキュベーターでそれを元に戻します。攪拌を3回繰り返して、最大の開口部からピペットチップを使用して、各時間が狭いと、それぞれの間に15分間インキュベーションします。 </li><li>最後の15分間のインキュベーション後、アウトとフードにサンプルを取ります。ピペット溶液を上下に30回、最も狭い開口部を有するピペットチップを使用して、新しい50ミリリットルチューブに40μmのセルストレーナーを通過します。 </li><li> 10mLのピ​​ペットを用いて10mLの洗浄緩衝液で皿を洗浄し、セルストレーナーに移します。 RTで10分間、400gで遠心分離し、スピンに50ミリリットルチューブを入れてください。 </li></ol>ビーズとitle &quot;&gt; 8。洗濯と共役<ol><li>ペレットを中断することなく、上清を取り除きます。二回5ミリリットル洗浄バッファーで細胞を洗浄。 </li><li>以前の1は、一度に1つのチューブにビーズや仕事1.5 mlチューブを用意しましょう​​。 、磁性板で1 1.5mlチューブを入れて3回振ると、それを開きます。 </li><li>最後の遠心分離後、ペレットを中断することなく、できるだけ多くの上清を除去します。積極的にフリックすることにより細胞塊の関連付けを解除します。 </li><li> 50mlチューブに1mLの洗浄緩衝液を追加し、1 mlピペットで細胞を混合します。 1.5ミリリットルチューブからソリューションをダンプし、ビーズに50ミリリットルチューブから細胞懸濁液の1ミリリットルを追加します。チューブを30回フリック、その後30分間、4ºCで回転します。 </li></ol> 9.細胞培養/イメージングのための準備<ol><li>細胞をプレーティングするためのチャンバーを準備します。表面もコーティングするためにチャンバーにゼラチン溶液（w / vの5％、300μl）を加え、37ºCで30分間インキュベートします。インキュベーション後、REMオベゼラチン及び乾燥した表面。 </li><li>回転の30分後にビーズ/細胞とチューブを取り出し、フード内部の磁気プレートに入れました。 2分、ダンプのために振ると1ミリリットルの洗浄緩衝液を追加します。 </li><li>プレートの外にチューブを取り、勢いよく30回、その後フリック30回振ります。磁性板でそれらを元に戻し、1分間振ります。 5回の洗浄の合計4回繰り返したが、1分がプレートに振盪しながら。 </li><li>最後の洗浄後、1チューブを取り出して、時に各チューブ1に取り組んでいます。その後、30回フリック30回振ります。磁性板の上に置き、1分間振ります。ダンプと1ミリリットル20％IFCS ECのメディアを追加（37ºCで予め温めておきました）。 </li><li>勢いよく30回、その後フリック30回振ります。 500μlのピペットを上下に10回ピペットを調整します。各チャンバーに500μlのを転送します。 </li><li> 37ºCインキュベーターに入れて、O / Nを残します。翌日、10％FBS EC培地で細胞を洗浄。 </li></ol>ウェスタンブロット（WB）サンプルについて10の準備<ol><li>ターク回転の1時間後にビーズ/細胞とチューブを電子。磁気プレートに入れ、2分間振ります。上清をダンプし、冷HBSS 1ミリリットルを追加します。勢いよく30回、その後フリック30回振ります。 3回の洗浄のために二度繰り返しますが、1分がプレートに振盪しながら。 </li><li>最後の洗浄後、磁性板にチューブを入れて、1分間振ります。ピペットを使用してバッファを削除し、以前に11,12を説明した方法を用いて、WBのための細胞を溶解します。収集された溶解物を、通常は約30μgのタンパク質のが含まれています。 </li></ol> 11.イメージング<ol><li>チャンバー250μlの最終容量で、メディアで細胞を3回洗浄します。細胞へのDil-acLDLの1.5μlを添加します。この点から、暗闇の中で細胞を維持します。 </li><li> 37℃で3.5時間インキュベートします。 、ヘキストの1.5μLを加え、よく混ぜて、PBSで37˚C.Wash細胞で30分間インキュベートし、室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定します。 </li><li> PBSで2回洗浄し、30マイル、5％BSA-PBSでブロックRTでのn。 1％BSA-PBSで2回洗浄します。 2μg/ mlの濃度に1％BSA-PBSを用いてBS-レクチン-FITCを希釈し、各チャンバーに300μlを添加します。 </li><li>室温で30分間オービタルシェーカー上室を置きます。 PBSで3回洗浄します。 </li><li> FITC（レクチン染色、ECマーカー、励起/発光の488nm / 519 nm）を、DAPI（ヘキスト、358 nmでの核染色、励起/発光/ 30ミリ秒200ミリ秒の露光時間で蛍光顕微鏡下で細胞を可視化461 nm）であり、557 nmの/ 576 nm）におけるTRITC（acLDL染色、ECマーカー、励起/発光のための300ミリ秒。 20X対物レンズを使用して画像を取得します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

研究において最も広く使用されている内皮細胞は、その利便性と培養の容易さのヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）です。しかし、多くの研究は、他の特定の臓器10からの内皮細胞の単離によって達成生理学的モデルの可用性を必要とします。内皮細胞は、心臓組織内の細胞の非常にマイナーな人口を構成しています。それらの単離および培養は非常に困難であることを証明することができます。 このプロトコル内の3つの重要なステップがあります。最初は、血液をよくフラッシュすることです。血液中の白血球は、細胞表面マーカーとしてCD31を発現し、CD31抗体の結合についてのECに対して競合するように、これは、必要です。他の内皮細胞は、血液中に存在することができるように、フラッシングは、このような細胞による汚染を防止するために不可欠です。第二の重要な工程は、分離プロセスを通じて無菌環境を維持することです。任意の汚染RESU達成細胞の数の劇的な減少でLTS。最後に、第三の重要なステップは、そうしないとは分離の効率を低下させるように、CD31の緩衝液のpHを調整することです。 <p class="...

様々な心血管疾患および代謝性疾患のマウスモデルは、患者に見られるものと類似している生理学的および分子的変化を負います。さらに、マウスの遺伝的変化は、私たちが疾患の発症と進行における特定の遺伝子の病原性の役割を調査することを可能にする強力なツールです。今日では、細胞型特異的遺伝子ノックインまたはチェックアウトマウスは簡単に多くの研究室で生成され、特定の細胞型におけるmRNAおよびタンパク質レベルの測定は、マウスは本当に遺伝的に変更されたかどうかを決定するための最初のステップであるされています。 内皮は、内皮細胞（EC）のラインの内側血管壁の薄い単層です。内皮細胞は、血管緊張、血管透過性、および新しい血管の形成1,2の調節に重要な役割を果たしています。内皮機能障害は、多くの病的状態および内皮機能の変化の顕著な特徴は、様々な車につながる可能性がありますdiovascular疾患3,4。生理学的および病態生理学的条件下での内皮細胞の機能を研究することが重要です。 電気部品5-8と分離法が使用される組織および種に応じて最適化する必要がある単離するためのいくつかの方法があります。異なる組織からのECは、それらの表面マーカーおよびタンパク質発現9に対して異質の高いレベルを表示するためです。内皮細胞の成功の分離は、しばしば挑戦することと訓練と実践のいくつかの学位を必要とすることができます。達成されると、このプロトコルで提案された単離方法は、安定的かつ効率的であることがわかります。 この方法の全体的な目標は、高品質と量のマウス冠状動脈のEC（MCECs）を得ることです。心臓から採取した細胞の量は、他の技術を用いて他の組織から採取した細胞よりも少ない場合でも、この技術はまだ賭けを提供しますターの品質。得られた集団における内皮細胞の純度は90％以上です。したがって、この技術は、細胞イメージングとして純粋に単離された内皮細胞に依存するアプリケーションのために理想的です。

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャー</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>フィッシャー</td><td>SH3026801</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads パンマウス IgG ビーズ&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD31抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>IFCS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>SH30072.04</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher</td><td>MT10060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (Neutral Protease)</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS02109</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II&nbsp;</td><td>ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション/フィッシャー</td><td>・LS004176</td><td></td></tr><tr><td>・グリセロール&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP381-1</td><td></td></tr><tr><td>イゲパル</td>シ<td>グマ</td><td>I3021-50ml</td><td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤カクテル</td><td>シグマ</td><td>P0044-1ml</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>シグマ</td><td>P8340-1ml</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>フィッシャー/メディアテック</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>D-バリン</td><td>シグマ</td><td>V1255-5G</td><td></td></tr><tr><td>EGS</td><td>コーニング</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー/メディアテック</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの冠動脈内皮細胞の単離

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

内皮細胞は、血管の内壁を裏打ちし、血管緊張、血管透過性、および新血管形成の調節に重要な役割を果たしています。内皮細胞の機能障害は、虚血性心疾患を含む多くの心血管疾患の発症および進行に関与しています。冠動脈内皮細胞の機能と特徴付けを調べるために、細胞の単離は、最初のステップであり、それはその後の実験を行うために、高純度と量を必要とします。このプロトコルは、成体マウス冠動脈内皮細胞を単離するための効率的な方法を説明します。マウスの心臓を切開し、小片に刻んだされます。ディスパーゼおよびコラゲナーゼIIを使用して、心臓の消化の後、細胞を洗浄し、抗CD31抗体に結合された磁気ビーズと共にインキュベートしました。内皮細胞とビーズを数回洗浄し、様々な用途で使用する準備ができている、イメージングおよび分子生物学的experime含めていますNTS。効率的な分離は、90％以上の純度で1心あたり約10 4個の細胞が得られます。

マウスの心臓から冠動脈内皮細胞の正常な分離は、典型的には、石畳の形状と90％以上の純度で約10 4個の細胞が得られます。内皮細胞の純粋な集団のために、注意が汚染のない無菌環境を確保するためのプロトコル全体で取られるべきです。細長い細胞または集団内の拡大された細胞の出現は、他の細胞型、平滑筋細胞および線維芽細胞の混入を示します。内皮細胞の純度試験は、内皮細胞表面マーカー、BS-レクチン及びacLDL（ 図1）で細胞を染色することによって行われます。両方の色を呈する陽性細胞のパーセンテージはMCECで90％以上でした。このような結果は、技術が正常に実行されたことを示しています。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> PBS（10×）（1 L） </td><td> &lt;/ TD&gt; </tr...

このプロトコルは、イメージングや分子生物学的実験を行う目的でマウスの冠状細胞を分離する方法を共有するために準備されています。

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

本実験の目的は、高度に精製された高品質なマウス冠動脈内皮細胞を大量に得ることです。この手法は、心血管研究分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、高品質な内皮細胞を高収量で回収できる点にあります。本手順の実演は、リサーチスペシャリストのShizhen Luoと、責任研究者のAyako Makino博士が行います。手順の最大1週間前に、サンプル1つにつき1.5 mLマイクロ遠心チューブ1本を用意し、CD31バッファーを1 mL加えます。次に、sheep antirad IGG beadsを緩やかなピペッティングで混合し、適切な量のビーズを各チューブに加えます。すべてのビーズを添加した後、チューブを30回激しく振盪し、マグネットプレート上に置いて1分間振盪します。次に、チューブをプレートに付けたままバッファーを捨て、各チューブに新鮮なCD31バッファーを1 mL加えます。rad抗マウスCD31抗体を2 µL加え、チューブを4 °Cのローテーターで一晩置きます。翌日、ラミナーフローフード内でチューブを移し、再度マグネットプレート上に置いて1分間振盪させます。次に、上清を1 mLの新鮮なCD31バッファーに置き換え、手でチューブを30回激しく振ります。3回目の洗浄後、チューブを4 °Cのローテーターに戻します。処置当日は、まず血液凝固を防ぐため、実験動物にヘパリン0.1 millilitersを腹腔内投与します。10分後、ペントバルビタール0.01 millilitersを注射してマウスを麻酔します。その後、足指へのピンチ刺激に反応がないことを確認してください。心臓と肺の組織を同時に摘出した後、それらをKrebs緩衝液を入れたビーカーに入れ、緩やかに揺らして組織を洗浄します。次に、新鮮なKrebs緩衝液を入れた6cmディッシュに組織を移し、はさみとピンセットを用いて肺葉を除去します。続いて、大動脈に20ゲージのカテーテルを挿入し、ヘパリンを添加したHBSSで冠循環系をフラッシュします。血液をすべて除去した後、心室に小さな切開を加え、心臓を穏やかに振って洗浄し、心臓組織を氷上のサンプルチューブに入れます。組織を消化して冠動脈内皮細胞を遊離させた後、細胞をペレット化し、5 mLの洗浄バッファーで2回洗浄します。次に、あらかじめ調製したビーズの入ったチューブをマグネットプレート上に置き、チューブを3回振ってビーズを均一に分散させます。2回目の洗浄後、ペレットを乱さないようにして上清をできる限り除き、チューブを強くはじいて細胞を遊離させます。次に、1 mLの洗浄バッファーを加え、穏やかに混ぜて細胞を再懸濁し、ビーズからCD31バッファーを除去します。細胞とビーズを合わせ、チューブを30回はじいて混ぜ合わせます。次に、細胞とビーズの溶液をローテーターに載せ

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここで、我々は、マウス肺内皮細胞の単離と培養のためのプロトコルについて説明します。このメソッドは、メカニックと酵素肺組織の解離と同様に抗PECAM - 1とほとんどが微小血管起源の純粋な内皮細胞集団を生成する磁気ビーズへの結合抗ICAM -...

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

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プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

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マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

我々は、1細胞オミクス実験を行うために、安定したまたは乱れた流動条件にさらされたマウス頸動脈の内腔から内皮細胞および核を単離する方法を提示する。...

シングルセルマルチオミクス実験のためのマウス頸動脈内腔からの内皮細胞の単離

この記事では、新生児マウスから初代肺内皮細胞を単離し、培養しました。...

初代マウス肺内皮細胞の単離

このプロトコルは、全膵臓からのマウス内皮細胞の単離を説明しています。...

マウス膵臓内皮細胞の単離

学ぶマウス冠動脈内皮細胞の単離法。CD31バッファーとIGGビーズを用いて高純度・高収量の細胞を取得し、心血管研究のイメージングや分子生物学実験に応用できます。

マウスの冠動脈内皮細胞の単離

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