3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비

본 실험 절차의 전체적인 목표는 3D 환경 내에서 세포 이동 또는 기타 세포 프로세스를 관찰하기 위해 정렬된 및 무작위 3D 콜라겐 매트릭스를 생성하는 것입니다. 이 방법은 실제 조직에서 발견되는 콜라겐 특성을 구현하도록 설계되었으며, 이는 세포가 정렬된 또는 무작위 extracellular matrix를 인식하는 데 사용하는 메커니즘과 같은 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3D 환경의 조직을 조절하고 그 내부의 세포를 이미징할 수 있으며, 이를 일반적으로 사용 가능한 장비를 통해 비용 효율적으로 수행할 수 있다는 점입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 콜라겐 용액과 중화 완충액을 충분히 섞지 않거나, 채널을 통해 콜라겐을 일관성 없게 흡입하여 어려움을 겪습니다. 이 과정은 제 실험실의 선임 연구원인 Brian Burkel이 시연할 것입니다. 우선, 콜라겐의 적절한 중화를 위해 세포와 배지를 추가하기 전 콜라겐과 HEPES 완충액을 충분히 혼합하십시오.

그 다음, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 중화된 콜라겐 혼합물에 세포와 배지를 추가하고 얼음에 둡니다. 콜라겐 겔 외부에서 세포가 부착 및 성장하는 것을 최소화하기 위해, 얼음처럼 차가운 혼합물을 멸균된 비조직 배양 처리 표면에 피펫으로 분주합니다. 피펫을 사용하여 용액을 고르게 펴줍니다.

젤을 실온에서 약 10분에서 15분 동안 중합시킵니다. 그다음, 젤을 덮고 37 °C 인큐베이터로 옮겨 45분에서 60분 동안 추가로 중합을 완료합니다. 중합이 완료되면 젤은 불투명하게 변합니다.

중합이 완료되면 배지 2~3 mL를 첨가합니다. 그 다음, 200 µL 피펫으로 웰의 둘레를 따라 돌려 웰 측면에서 젤을 분리합니다. 디쉬를 부드럽게 흔들어 바닥 표면에서 젤을 분리합니다.

콜라겐 매트릭스를 정렬하기 위한 PDMS 마이크로채널을 제작합니다. 먼저, 다른 문헌에 기술된 표준 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 SuA 실리콘 마스터를 준비합니다. 그다음, 일회용 컵에 엘라스토머 베이스 20 grams와 경화제 2 grams를 넣고 공예용 스틱을 사용하여 충분히 혼합합니다.

잘 섞였다면, 일회용 컵을 550 millimeters of mercury의 진공 압력이 가해지는 진공 챔버에 넣어 PDMS 혼합물의 기포를 제거합니다. 혼합물의 기포를 약 1시간에서 1시간 30분 동안 제거합니다. PDMS의 기포를 제거하는 동안, 핫플레이트 위에 깨끗한 투명 필름 시트를 놓고 그 위에 실리콘 마스터를 올려 실리콘 마스터를 준비합니다.

마이크로 채널 몰드가 위를 향하게 하십시오. 1~1.5시간 후, 탈기된 PDMS를 진공 챔버에서 꺼냅니다. PDMS를 마스터의 중앙에 천천히 붓고 중력에 의해 고르게 퍼지도록 합니다.

다음으로, 기포가 생기지 않도록 실리콘 마스터와 PDMS 위에 두 번째 투명 필름 시트를 조심스럽게 굴려 덮습니다. 투명 필름 위에 고무 시트를 살며시 놓은 다음, 1/8 inch 두께의 아크릴 시트를 올립니다. 그 후 아크릴 시트 위에 10파운드 무게추 3개 중 첫 번째 무게추를 올립니다. 처음에는 첫 번째 무게추가 뜰 수 있으므로, 나머지 두 개의 무게추 판을 올리기 전에 무게추가 완전히 안착되어 안정될 때까지 기다립니다.

계속할 준비가 되면 핫플레이트를 70 °C로 설정하고 PDMS를 4시간 동안 경화시킵니다. 경화가 완료되면 PDMS를 최소 1시간 더 식힌 다음, 웨이퍼 위의 상단 투명 필름을 조심스럽게 벗겨냅니다. 마지막으로 핀셋을 사용하여 채널을 제거합니다.

새로운 깨끗한 투명 필름 위에 채널을 뒤집어 놓은 다음, 뾰족한 핀셋을 사용하여 원을 그리듯 모든 포트를 세척합니다. 떨어져 나오는 PDMS 파편을 모두 제거합니다. 다음으로, 작업대에 포장용 테이프의 접착면이 위로 오도록 붙이고, PDMS 채널을 테이프 위에 뒤집어 놓습니다.

핀셋의 둥근 끝부분으로 채널을 눌러 접촉이 잘 되도록 합니다. 채널을 꺼내고 눈에 보이는 모든 잔해물이 제거될 때까지 양측 모두에서 이 과정을 반복합니다. 그런 다음, 세척 및 준비가 완료된 PDMS 채널을 70% ethanol이 채워진 50 milliliter 원심 분리 튜브(conical tube)로 옮깁니다.

최대 속도로 30초 동안 채널을 볼텍싱한 후, 용액을 신선한 70% ethanol로 교체합니다. 무균 조작법을 사용하여 PDMS 채널의 윗면이 위로 향하게 하여 깨끗하고 멸균된 접시에 옮깁니다. 그런 다음, ethanol이 모두 증발할 때까지 채널을 UV 처리합니다.

건조가 완료되면, 채널을 커버슬립이나 유리 바닥 디쉬 위에 뒤집어 놓고 유리에 밀착시켜 밀봉합니다. 채널의 중앙 부분을 덮어 닫을 수 있도록 멸균된 PDMS 패치를 추가하고, 다음 단계로 진행하기 전 설정된 장치를 충분히 건조시킵니다. 그다음, 10 $\mu\text{g/mL}$ 콜라겐 용액 100 $\mu\text{L}$ 방울을 채널 상단에 떨어뜨리고 진공 장치를 사용하여 채널 내부로 끌어당깁니다.

채널을 37°C에서 1시간 동안 배양한 후, 콜라겐 코팅 용액이 채워진 상태 그대로 채널을 냉장고로 옮깁니다. 장치를 약 15~30분 동안 냉각시킨 다음, 흡입기나 피펫을 사용하여 채널에서 콜라겐 코팅 용액을 제거합니다. 먼저 콜라겐 용액을 세포 배지로 희석하여 중화시키고 얼음 위에서 15분 동안 배양하는 과정부터 시작하십시오.

그런 다음, 미리 냉각된 채널의 포트 A에 콜라겐 용액 120~150 µL를 넣습니다. 다음으로, 25 mL 피펫을 진공 라인에 연결하고 포트 C 위에 배치합니다. 이를 사용하여 혼합물을 한 번의 균일한 동작으로 끌어당기며, 콜라겐이 끝에 도달하면 멈춥니다. 무작위 매트릭스를 생성하는 데 있어 가장 중요한 단계는 콜라겐을 채널을 통해 천천히 끌어당기는 것입니다.

용액을 너무 빠르게 끌어당기면 채널의 일부 또는 전체 영역에서 정렬도가 증가하게 됩니다. 포트 영역에서 과잉 용액을 조심스럽게 제거한 다음, 포트 A와 C 모두에 멸균된 PDMS 패치를 부착하십시오. 2~3분 후, 포트 B를 덮고 있는 중앙 PDMS 패치를 제거하고 1~3 x 10⁶ cells/mL 농도의 세포 용액 2~3 µL를 중앙 포트에 첨가하십시오. 실온에서 10~15분 동안 더 방치하여 겔이 부분적으로 중합되도록 한 다음, 제작물을 37 °C 인큐베이터로 옮겨 15~30분 동안 추가로 배양하십시오.

중합이 완료되면 PDMS 포트 커버를 제거하고 채널이 완전히 잠기도록 배지를 추가합니다. 여기서는 50,000개의 4T1 세포를 2 mg/ml 또는 3.5 mg/ml 콜라겐 겔에 5일 동안 배양하였습니다. 4T1 세포주는 수축력이 매우 강한 유선암 세포주이지만, 고밀도 겔은 약 10%만 수축시킬 수 있었습니다. 반면, 동일한 기간 동안 동일한 조건의 저밀도 겔은 57% 수축되었습니다.

콜라겐 정렬도는 콜라겐의 유속에 의해 조절되며, 유속이 높을수록 더 우수한 정렬을 얻을 수 있습니다. 더 좁은 채널과 더 높은 진공 압력을 함께 사용하면 콜라겐 네트워크의 정렬이 향상되는 반면, 낮은 진공 압력과 함께 넓은 채널을 사용하면 무작위 매트릭스가 생성됩니다. 숙련된 후 적절하게 수행한다면, 콜라겐 겔 또는 채널 주입은 2시간 30분 만에 완료할 수 있습니다.

이 실험 절차를 수행할 때, 시작 전 구성 요소들을 미리 준비하는 것이 중요합니다. 콜라겐을 사용하기 시작한 후에는 신속하게 작업해야 합니다. 이 기술은 개발 이후 3D 세포 생물학 분야의 연구자들이 3차원 세포외 환경으로의 세포 부착, 이동 및 침습을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 다양한 밀도의 콜라겐 겔을 만드는 방법과 무작위 및 정렬된 콜라겐 매트릭스를 모두 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.