RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

이 분석의 전반적인 목표는 차세대 염기서열 분석을 위해 표적 전사체를 농축하는 것입니다. 이 표적 RNA 시퀀싱 분석은 총 RNA에서 리보솜 RNA를 제거하는 것으로 시작하여, 화학적 단편화 및 상보적 DNA 합성, 바코드 라이브러리 제작, 표적 전사체의 하이브리다이제이션 및 캡처, 멀티플렉싱 시퀀싱을 거쳐 데이터 분석으로 마무리되는 다단계 절차입니다. 본 영상에서는 4개 샘플에 대한 하이브리다이제이션, 표적 캡처 및 캡처 후 PCR 증폭 절차를 시연하겠습니다.

따라서 이 방법은 유전자 융합, 단일 염기 변이, 상대적 유전자 발현 및 표적 전사체와 관련된 선택적 스플라이싱의 확인과 같이 분자생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 있는 모든 유전자에 맞게 맞춤 설정이 가능하다는 점입니다. 하이브리드화 절차를 시작하려면 20 °C 냉동고에서 다음 항목들을 꺼내 얼음 위에서 해동하십시오: 맞춤형 하이드레이션 프로브, Cot-1 DNA, 범용 블로킹 올리고, 그리고 어댑터 특이적 블로킹 올리고.

저결합 1.5 milliliter 튜브에 500 nanograms의 DNA 샘플, 5 microliters의 Cot-1 DNA, 1 microliter의 범용 블로킹 올리고(universal blocking oligos), 0.5 microliters의 6-뉴클레오타이드 어댑터 특이적 블로킹 올리고(six nucleotide adapter specific blocking oligos), 그리고 0.5 microliters의 8-뉴클레오타이드 어댑터 특이적 블로킹 올리고(eight nucleotide adapter specific blocking oligos)를 혼합합니다. 샘플 튜브의 캡을 열고 회전 방향의 반대쪽을 향하게 하여 진공 농축기에 넣습니다. 45 degrees Celsius에서 20분 동안, 또는 액체가 완전히 증발할 때까지 건조합니다.

다음으로, 건조된 내용물을 8.5 µL의 2x 하이브리다이제이션 버퍼, 3.4 µL의 하이브리다이제이션 성분 A, 그리고 1.1 µL의 nuclease-free water로 재부유시킵니다. 2.5분마다 볼텍싱하며 10분 동안 재부유시킵니다. 재부유된 물질을 0.2 mL PCR 튜브로 옮기고 써멀 사이클러를 이용하여 95 °C에서 10분 동안 인큐베이션합니다.

열 순환기에서 하이브리다이제이션 샘플 튜브를 꺼내고 1.5 pmol/µL 농도로 재현탁한 커스텀 프로브 2 µL를 추가합니다. 하이브리다이제이션 반응물을 65 °C에서 밤새 배양합니다. 멀티플렉스 하이브리다이제이션 이후의 다음 단계는 스트렙타비딘이 결합된 상자성 비드를 사용하여 표적 RNA를 캡처하는 것입니다.

4 °C에서 보관된 비드 병을 꺼내 실온에서 30분 동안 평형을 맞춥니다. 필요한 모든 버퍼의 1x 작동 용액을 준비합니다. 신선한 1.5 mL 튜브에 1x wash buffer one 140 µL를 분주합니다.

이 aliquotic buffer와 1x stringent buffer 전량을 히트 블록을 사용하여 65 °C에서 최소 2시간 동안 가열하십시오. 적절한 양의 비즈를 1.5 mL 튜브에 분주하십시오. 이를 자석 분리 랙에 놓고 상층액을 제거하십시오.

비드 세척 버퍼를 추가하고 10초 동안 볼텍싱합니다. 튜브를 자성 분리 랙에 2~5분 동안 또는 상층액이 투명해질 때까지 둡니다. 상층액을 제거합니다.

총 2회 세척할 때까지 이 과정을 반복합니다. 비드 세척 버퍼를 제거한 후, 초기 시작 부피와 동일한 양의 비드 세척 버퍼를 추가합니다. 이를 재현탁하여 0.2 milliliter PCR 튜브로 옮깁니다.

튜브를 자석 랙에 2~5분 동안 또는 상층액이 투명해질 때까지 둡니다. 상층액을 제거합니다. 비즈가 들어 있는 튜브를 65 °C의 미니 히팅 블록에 넣습니다.

하이브리드화 샘플을 비드가 들어 있는 튜브로 옮기고, 피펫팅을 10회 반복하여 혼합한 후 65 °C에서 45분 동안 배양합니다. 15분마다 샘플을 볼텍싱하고 고정 속도 테이블탑 미니 원심분리기를 사용하여 4초 동안 스핀 다운합니다. 45분간의 배양이 완료되면 히팅 블록에서 캡처 튜브를 꺼냅니다.

미리 가열한 1x wash buffer one 100 µL를 튜브에 넣고, 10초 동안 볼텍싱하여 혼합합니다. 혼합물을 새로운 low-binding 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 2~5분 동안 또는 상층액이 투명해질 때까지 분리될 때까지 기다립니다.

상층액을 버립니다. 미리 가열된 1x stringent wash buffer 200 microliters를 넣고, 파이펫으로 10회 상하로 섞어줍니다. 65 degrees Celsius에서 5분 동안 배양합니다.

튜브를 마그네틱 랙에 넣고 2~3분 동안 분리되도록 둡니다. 상층액을 제거합니다. 엄격한 세척(stringent wash) 과정을 한 번 더 반복하여 총 2회 세척합니다.

실온의 1x 세척 버퍼 1을 200 microliters 추가하고 2분 동안 볼텍싱하여 혼합합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 2~5분 동안 분리시킨 후 상층액을 제거합니다. 실온의 1x 세척 버퍼 2를 200 microliters 추가하고 1분 동안 볼텍싱하여 혼합합니다.

튜브를 자성 분리 랙에 2~5분 동안 두고, 상층액을 제거합니다. 실온의 1x wash buffer three 200 µL를 첨가하고 30초 동안 볼텍싱하여 혼합합니다. 튜브를 자성 분리 랙에 2~5분 동안 두고, 상층액을 제거합니다.

마지막으로, 자성 분리 랙에서 튜브를 꺼내고 20 µL의 nuclease-free water를 첨가하여 비드를 재현탁합니다. 피펫팅을 10회 반복하여 충분히 혼합합니다. 포획 후 PCR 증폭을 준비하기 전에, 4 °C에 보관된 상자성 비드를 꺼내어 실온에서 30분 동안 평형화합니다.

2x hot start PCR ready mix와 PCR primer mix를 20 °C 냉동고에서 꺼내 실온에서 해동한 후 얼음에 둡니다. 2x hot start PCR ready mix 27.5 µL, PCR primer one 2.75 µL, PCR primer two 2.75 µL를 혼합하여 라이브러리 증폭 마스터 믹스를 준비합니다. PCR 튜브에 비드 및 캡처된 DNA 20 µL와 라이브러리 증폭 마스터 믹스 30 µL를 첨가하여 반응을 설정합니다.

튜브 캡을 제대로 닫고 볼텍스로 혼합합니다. 6 ×g의 고정 속도 미니 테이블탑 원심분리기를 사용하여 튜브를 4초 동안 원심분리합니다. 튜브를 써멀 사이클러에 넣고 다음 PCR 프로그램에 따라 PCR 증폭을 시작합니다. 98 °C에서 45초 동안 초기 변성, 98 °C에서 15초 동안 변성, 65 °C에서 30초 동안 어닐링, 72 °C에서 60초 동안 신장을 10~12회 반복합니다.

75°C에서 60초 동안 마지막 신장 사이클을 한 번 더 수행한 후, 4°C에서 보관합니다. PCR이 완료되면 써멀 사이클러에서 샘플을 꺼냅니다. 상자성 비드 75 µL를 첨가하고 잘 섞은 후, 실온에서 15분 동안 배양합니다.

튜브를 실온의 마그네틱 랙에 2~3분간 두고 상층액을 제거합니다. 80% ethanol 200 µL를 가하고 30초간 배양한 다음 상층액을 제거하여 마그네틱 랙 위의 비드를 세척합니다. 이 과정을 총 2회 반복합니다.

두 번째 에탄올 세척 후 상층액을 제거하고, 비즈가 건조될 수 있도록 상온에서 5~10분 동안 배양하되, 갈라질 정도로 과하게 건조하지 마십시오. 비즈를 22 µL의 Tris-EDTA pH 8.0에 재현탁하고 3분 동안 용출시킵니다. 샘플을 자석 위에 3~5분 동안 둡니다.

마지막으로, 비드가 섞여 들어가지 않도록 주의하며 용출된 생성물 20 µL를 새로운 저결합 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 4종의 암 세포주에서 캡처 방법과 비표적 RNA 시퀀싱의 유전자 발현 비교 결과, 캡처 방법은 파란색으로 표시된 표적 유전자를 회색으로 표시된 비표적 유전자에 비해 10배에서 1000배까지 농축시켰음을 확인했습니다. 또한, 비표적 RNA 시퀀싱 라이브러리에 비해 캡처 라이브러리에서 표적 영역에 매핑되는 리드의 비율이 증가했습니다.

품질 관리 조치를 평가한 결과, 캡처 방식과 비표적 RNA 시퀀싱은 전사체 정렬 및 주요 삽입 크기 측면에서 동일한 성능을 보이는 것으로 나타났습니다. 캡처 방법을 사용했을 때 엑손 영역의 시퀀싱 비율은 더 높았고, 인트론 영역의 비율은 더 낮았습니다. 예상대로, 비표적 RNA 시퀀싱은 캡처 방식보다 샘플당 총 시퀀싱 리드 수를 50배 이상 더 많이 생성했습니다.

캡처 방법을 사용했을 때, 각 샘플에 존재하는 리보솜 RNA 서열의 비율이 더 낮았습니다. 마지막으로, 4가지 세포주 각각에 대해 캡처와 RNA 시퀀싱의 중첩 영역에서 호출된 단일 염기 변이(single nucleotide variants)를 비교한 결과, 표적 영역 내에서 캡처와 RNA 시퀀싱 간의 변이에 높은 일치도가 나타났습니다. 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행될 경우 3~4일 만에 완료할 수 있습니다.

본 절차를 수행할 때, 하이브리드화된 표적을 캡처하는 동안 신속하게 작업하고 반응 온도가 65 °C로 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 이 기술의 발전으로 분자생물학 분야의 연구자들은 관심 있는 전사체를 고효율 및 비용 효율적인 방식으로 연구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.