中に組み込み血管新生による組織工学

この手順の全体的な目的は、組織が成長・拡大すると同時に、強固な血液供給系が発達できる空間を構築し、最終的に血管を有する大きな三次元組織ブロックを生成することです。この手法は、再建目的の血管組織エンジニアリングや、臓器の置換および修復における重要な課題の解決に寄与します。この技術の主な利点は、新たに生成された組織が、生存のために周囲からの拡散に頼ることなく、組織固有の血管ネットワークによって内因的に血液を供給されることです。

手順の実演は、Sue McKayとLiliana Pepeが行います。体重250 g以上のラットを麻酔し、足指のつまみ刺激によって麻酔深度を確認してください。ラットに反応が見られない場合は、処置の間、2% isofluraneを用いて鎮静状態を維持します。

次に、眼にエプソム軟膏を塗布します。続いて、ラットを仰臥位にし、電気シェーバーで鼠径部を剃毛した後、湿らせたガーゼで毛を取り除きます。その後、70% ethanolを含むクロルヘキシジン溶液で手術部位を洗浄します。

最後に、動物を滅菌タオルでドレープし、手術に進みます。15番メスを用いて、鼠径靭帯に平行に左鼠径部へ4 cmの皮膚切開を加えます。次に、露出した鼠径脂肪体を、上腹壁動静脈に基づく血管茎に付着させたまま、ハサミで周囲を切り離します。

次に、マイクロシザーを用いて、腹壁と下層の大腿血管との間にある薄い結締組織の癒着を剥離します。その後、腹壁にリトラクターを配置し、内側に牽引して、鼠径靱帯と大腿血管の全長を露出させます。次に、マイクロフォーセプスと曲剪を用いて、腹壁下静脈を剥離し、周囲の脂肪から分離します。

この静脈はテザーとして機能します。大腿血管と神経を含む血管周囲鞘を開いて進めてください。鼠径靭帯から、上腹壁動脈分枝より遠位の分岐点まで完全に開きます。

この時点および全手順を通じて、大腿血管を慎重に取り扱うことが極めて重要です。血管を損傷させると血栓症を引き起こし、実験全体が失敗に終わる可能性があります。次に、マイクロピンセットを用いて大腿静脈の外膜をつかみ、周囲の組織および随伴する動脈から静かに分離させます。

この工程では、静脈壁の全層を把握しないでください。内膜に損傷を与え、静脈血栓症を引き起こしやすくなる可能性があります。また、この工程で、側枝を10-0ナイロン縫合糸で結紮するか、バイポーラ凝固器で凝固させます。大腿静脈を完全に遊離させた後、近位側と遠位側を4-0シルク縫合糸で結紮し、腹壁下枝を約0.5 cm含む、長さ10 mm以上の静脈グラフトを得ます。

この枝は、チャンバー内でループが開いた状態を維持するためのガイロープ（固定紐）として機能します。次に、グラフトの両端から外膜をトリミングします。必要に応じて、この工程はマイクロサージェリーによる吻合の直前まで延期しても構いません。

ヘパリン含有生理食塩水で洗浄し、ヘパリン含有生理食塩水を充填した状態で静置し、静脈グラフトの準備を完了させます。次に、4-0シルク糸を用いた連続縫合と、さらに2〜3針の単純結節縫合で創部を閉鎖します。まず、前述の手法に従い、対側肢の鼠径靭帯および大腿血管の全域を露出させます。

次に、マイクロ鉗子を使用して、上腹壁動脈と静脈の両方を周囲の脂肪組織から剥離し、単離します。血管から組織を剥がす際は、慎重に行ってください。続いて、大腿動脈の外膜をつかみ、周囲の組織から遊離させます。

この工程では、動脈の側枝を結紮または凝固させます。次に、大腿動脈と大腿静脈の両方の近位側をクランプします。そして、4-0シルク縫合糸を用いて、腹壁下動静脈の分岐点より遠位で大腿動脈と大腿静脈を結紮します。

次に、血管の下に滅菌済みのプラスチック製コントラスト背景を配置し、鋭利な直線型マイクロ剪刀を用いて各血管を横断的に切断します。切断後、管腔内からすべての血液が除去されるまで、十分な量のヘパリン加生理食塩水で血管内を強力に洗浄します。これで、静脈グラフトを術野に導入します。

静脈グラフトを配置し、近位端をレシピエントの大腿静脈に、遠位端をレシピエントの大腿動脈に吻合できる状態にします。これにより、静脈グラフト内部の弁による抵抗なく、動脈側から静脈側へ血液が流れるようになります。大腿血管と静脈グラフトにねじれがなく、自然な位置に収まっていることを確認してください。

10-0ナイロン縫合糸を用いて、両端に外科的吻合を行います。良好で非侵襲的なマイクロサージカル吻合を行うことが重要です。血管内膜の損傷、血管の乾燥、または縫合位置の不適切さは、吻合部位に血栓を形成しやすくさせる原因となります。

次に、両方の吻合部位に漏れがないか確認します。吻合部位から拍動のない血液が流出しているような小さな漏れがある場合は、その上に少量の脂肪組織またはスポンジを置き、5～10分間軽く圧迫して止血します。術野全体に急速に血液が充満するような拍動性の大きな漏れがある場合は、追加の縫合が必要です。

次に、動静脈ループの開通性を確認します。大腿動脈を軽く閉塞させると、ループは縮小するはずです。逆に、大腿静脈を閉塞させると、ループは充満します。

次に、組織工学チャンバーの底部を動静脈ループの下に配置します。ループがねじれたり折れ曲がったりすることなく、自然な位置に収まっていることを確認してください。その後、6-0ナイロン縫合糸を用いて、チャンバーの底部を鼠径靭帯およびその下の筋膜に固定します。

次に、チャンバーのベースの上に蓋を置きます。蓋の下で上腹壁動脈の枝を挟み、ループを固定します。その後、4-0シルク縫合糸を用いた連続縫合と、さらに2〜3本の単純結節縫合を用いて創 wounds を閉鎖します。

最後に、個別のケージ内で動物を麻酔から回復させ、鎮痛剤としてカルプロフェンを単回皮下投与します。これまでと同様に、動物の手術準備を行います。1匹のラットの左右それぞれの鼠径部に、計2つのチャンバーを植え込むことが可能です。

次に、前述の方法で大腿血管を単離します。動脈と静脈の両方を周囲組織から完全に遊離させ、分枝を結紮した後、チャンバーを術野に移動させます。そして、無傷の大腿血管をそれぞれチャンバー底部の対応するスリットに配置します。

どちらもねじれたり折れ曲がったりしていないことを確認します。次に、蓋をベースに取り付けてチャンバーを閉じます。その後、前述の手順に従って創部を閉鎖し、動物を回復させます。

組織工学チャンバーのマイクロサージャリーによる作製は、既報の通りに行った。このin vivo血管化チャンバーを用いることで、新生ラット心筋細胞を用いた心臓組織、ラット骨格筋芽細胞を用いた筋肉組織、および脂肪組織細胞外マトリックス由来のハイドロゲルを用いた脂肪組織など、さまざまな組織型の構築に成功した。ステレオロジーシステムにより、特定の組織体積の不偏な定量化が可能となる。

例えば、横断面におけるレクチン染色の血管内皮細胞を用いて、血管体積を推定しました。蛍光色素で標識した細胞を生体内に移植した後、その運命を追跡することが可能です。例えば、dye i で標識した新生ラット心筋細胞が、移植から3日後の組織構築物内で検出されました。

あるいは、異種移植研究において、導入された細胞を特定するために種特異的抗体を使用することも可能です。例えば、免疫不全ラットに移植したヒト人工多能性幹細胞を、チャンバーから回収した組織内で特定できます。習熟すれば、フロースルーチャンバーと動静脈ループの移植は、それぞれ約20分および90分で完了します。

この手順を行う際は、常に無菌状態を維持し、汚染が発生した場合には必要な措置を講じることが重要です。血管を丁寧に扱い、非外傷的な微小外科的吻合を行うことが成功の鍵であることを忘れないでください。そのため、本手順、特に動静脈ループの構築を試みる前に、基本的な微小外科トレーニングを受けることを推奨します。