Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Bu prosedürün genel amacı, siRNA gibi küçük moleküllü ilaçları beyne iletebilen bir taşıyıcı sistem tasarlamaktır. Bu yöntem, nörodejenerasyon alanındaki "siRNA, protein katlanma bozukluğu hastalıkları için uygulanabilir bir terapötik seçenek midir?" ve "Beyne yönelik güvenilir bir ilaç iletim sistemi tasarlayabilir miyiz?" gibi temel sorulara yanıt verebilir.

Lipozomal bir ilaç iletim sistemi oluşturmanın temel avantajı, siRNA'yı doğrudan nöronal doku üzerinden iletmek yerine (ki bu durum nöronal hasara yol açar) intravenöz olarak veya kan dolaşımı yoluyla iletebilmemizdir. Bu tekniğin etkileri, kan-beyin bariyerini aşarak özellikle asetilkolin eksprese eden nöronlara spesifik iletim sağlaması nedeniyle nörodejeneratif hastalıkların tedavisi ve teşhisine kadar uzanmaktadır. Fare kuyruk veni enjeksiyonlarının, kuyruk veninin küçük boyutu nedeniyle öğrenilmesinin zor olması sebebiyle, bu tekniğin görsel olarak gösterimi kritik öneme sahiptir.

İşe bir bire bir DOTAP ve kolesterol oranı hazırlayarak başlayın. Yabancı hayvan lipozom hazırlığı için, iki nanomol DOTAP ve iki nanomol kolesterolü, on mililitre bir bire bir kloroform ve metanol çözeltisiyle karıştırın. Ardından, kloroform ve metanol çözeltisinin dokuz mililitresini nitrojen gazı kullanarak uçurun.

Kalan son bir mililitre çözücüyü, gaz akışı olmadan bir çeker ocakta gece boyunca buharlaştırın. Ertesi gün, balonun dibinde ince bir lipid filmi görülmelidir. Lipid filmi içeren bu balonu ve on mililitrelik yüzde on sukroz çözeltisini 55 °C'ye ısıtın.

Ardından, erlenmeyle hafifçe çalkalayarak ısıtılmış sakkaroz çözeltisini ince lipid filminin üzerine yavaşça pipetleyin. Daha sonra, üretici talimatlarına göre bir mikronluk filtrelerle bir ekstrüder düzeneği kurun. Ardından, ısıtılmış lipozom süspansiyonundan bir mililitreyi ekstrüderdeki şırıngalardan birine ekleyin.

Ardından süspansiyonu iki şırınga arasında 11 kez geçirin. Daha kolay boyutlandırma için lipozom süspansiyonunu ısıtılmış olarak tutarken, lipozomları 45 mikron ve 2 mikronluk bir filtreden geçirerek boyutlandırın. Büyük, unilameller veziküller oluşturmak için, dört nanomolar lipozom süspansiyonunun 20 mikrolitresini, 20 mikromolar stok siRNA çözeltisinin 200 mikrolitresine ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika inkübe edin. Daha sonra, 500 mikromolar stok RVG-9R hedefleme peptidinin 80 mikrolitresini siRNA lipozom çözeltisine ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika inkübe edin.

2,2 nanomol DSPE veya DOTAP'ı, 1,6 nanomol kolesterol ve 2 nanomol DSPE peg ile birlikte, ikiye bir oranında kloroform ve metanol içeren on mililitrelik bir çözeltiye karıştırarak yabancı hayvan lipozom süspansiyonu hazırlayın. Ardından, azot gazı uygulayın ve çözücünün büyük bir kısmı buharlaştığında, balonu çeker ocakta gece boyunca bekletin. Daha sonra, ince lipid filminin üzerine 75 °C'ye ısıtılmış on mililitre 1X PBS'yi yavaşça ekleyin.

Boyutlandırma işleminden önce lipidlerin 75 °C'de en az bir saat boyunca yeniden hidrate olmasına izin verin. Lipozom süspansiyonunu daha önce olduğu gibi bir ekstrüder kullanarak boyutlandırdıktan sonra, dört nanomolar lipozom süspansiyonunun her birinden 20 µL'yi tek kullanımlık alikotlara pipetleyin ve masaüstü bir liyofilizatör kullanarak 30 dakika boyunca liyofilize edin. Ardından, siRNA'yı yoğunlaştırmak için 200 µL 20 µM stok siRNA çözeltisine 1,4 µL 26,6 µM protamin sülfat çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, DSPE paletlerini 201.4 µL siRNA protamin çözeltisi ile rehidrate edin. DOTAP paletlerini 200 µL yabancı hayvan siRNA stok çözeltisi ile rehidrate edin. Her bir lipozom siRNA çözeltisini oda sıcaklığında on dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, rehidre edilmiş lipozomların her bir tüpüne on µL 60 mM EDC çözeltisi ekleyin. Daha sonra, hem DOTAP hem de DSPE paletleri için lipozom siRNA çözeltisine on µL 150 mM sulfo-NHS çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.

Son olarak, siRNA lipozom çapraz bağlama çözeltisine 500 µM stok RVG-9R peptidinden 80 µL ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika boyunca inkübe edin. Oksijen içinde %2 ila %3 isofluran kullanarak bir fareyi anestezi altına aldıktan sonra, farenin gözlerini oftalmik pomad ile kapatın ve ayak parmağı sıkıştırma testi yaparak anestezinin gerçekleştiğini doğrulayın. Yalnızca reaksiyon yoksa işleme devam edin.

Anesteziyi sürdürürken, kuyruk venine erişmek için fareyi sırt üstü veya yan tarafına gelecek şekilde yerleştirin. Kuyruğu yüzde 70'lik etanol ile silin ve ardından kuyruk venine 300 microliter LSPC veya palet enjekte etmek için 26 gauge bir insülin şırıngası kullanın. Enjeksiyona distalden başlayın ve ven çökerse veya yırtılırsa proksimal yönde ilerleyin.

Fare, sternal recumbency (göğüs üzerine yatış) durumuna geçene kadar temiz bir kafese yerleştirin. Anestezi etkisinin geçip geçmediğini ve tedavinin herhangi bir olumsuz etkisinin olup olmadığını kontrol etmek için hayvanı enjeksiyondan sonra birkaç saat boyunca izleyin. LSPC'lerin veya paletlerin en az 24 saat boyunca dolaşmasına izin verdikten sonra fareyi ötanize ederek beynin bir hemisferinin yarısını disseke edin.

Ardından, yarım hemisferi ve 2,5 mililitre fax tamponunu 40 mikronluk bir hücre süzgecine yerleştirin ve dokuyu filtreden geçirerek bir petri kabına itmek için bir şırınga pistonu kullanın. Hücre süzgecini ve petri kabını ek 2,5 mililitre fax tamponu ile durulayın. Daha sonra tek hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve buz üzerine yerleştirin.

Ardından, hücre süspansiyonundan 100 µL'yi mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve 350 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı attıktan sonra, hücre peletini 1 mL fax tamponunda yeniden süspande edin ve tekrar santrifüjleyin. Daha sonra, bir mL daha fax tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonunu buza yerleştirin. Şimdi, hücreleri fax tamponu içinde 100 µL rat anti-mouse Fc blok ile buz üzerinde 30 ila 60 dakika inkübe edin.

Daha önce olduğu gibi çöktürme ve yıkama işlemlerinin ardından, 100 µL floresan primer antikor çözeltisi ekleyin ve 30 ila 60 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Son bir yıkamadan sonra, hücreleri bir dakika boyunca 1 mL RVC lizis tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri çöktürün.

Tamponu döktükten sonra, bir mililitre fax tamponu içerisinde yeniden süspanse edin ve buza yerleştirin. Hücreler artık fax analizi için hazırdır. LSPC'ler aracılığıyla iletilen siRNA ile tedavi edilen fareler, vahşi tip hücresel prion protein seviyelerini gösteren PBS kontrolüne kıyasla hücresel prion protein seviyelerinde anlamlı bir azalma göstermiştir.

LSPC ile tedavi edilen fareler, hücresel prion protein seviyelerinin prion protein nakavt (knock out) farelerin seviyelerine yakın olduğunu göstermiştir. Üç deney boyunca, LSPC ile tedavi edilen fareler, PBS ile tedavi edilen tip kontrollerine kıyasla hücresel prion protein seviyelerinde anlamlı düşüşler göstermiştir. Bu prosedür uygulanırken, lipozomların birkaç ay boyunca buzdolabında saklanabileceğini ancak tamamlanmış LSPC'lerin montajdan sonraki 24 saat içinde kullanılması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Geliştirilmesinin ardından, LSPC'lerin veya paletlerin üretimi, araştırmacıların nörodejeneratif hastalıklar alanında daha fazla terapötik seçenek keşfetmesinin önünü açacaktır.