의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록 Xenopus의의 laevis의

이 절차의 전반적인 목표는 코 상피에서 유도된 온도 강하에 대한 반응으로 후각구 뉴런의 칼슘 변화를 기록하는 것입니다. 이 방법은 후각구가 코에서 얻은 온도 정보를 통합하고 처리하는 방법과 같은 애정 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 후각구의 1차 및 2차 뉴런은 다르게 염색되며 비강 상피의 온도 변동의 영향은 칼슘 영상으로 측정됩니다.

세포 전기천공법(cell electroporation), 볼루스 로딩(bolus-loading) 및 활동 상관 관계 영상(activity correlation imaging)의 시각적 시연은 후각구 이외의 뇌 네트워크에서 이러한 기술의 구현을 용이하게 할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 젤 쿠션에 올챙이를 올려 놓습니다. 주변에 바늘을 놓아 고정하고 바늘이 피부를 찌르지 않도록 주의하십시오.

다음으로, 동물을 실체 현미경 아래에 놓고 콧구멍에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 비강 중 하나에 염료 결정을 놓고 완전히 용해될 때까지 기다리면 1분도 채 걸리지 않습니다. 결정이 더 작으면 반투명하지 않은 고농도 용액을 생성할 때까지 각 캐비티에 2개 또는 3개를 추가합니다.

그 후, 올챙이의 피부와 양극의 피부에 있는 음극을 콧구멍 중 하나에 놓습니다. 약 0.5초의 자극 간격으로 20볼트와 20밀리초의 6개 펄스를 적용합니다. 극성이 다른 염료의 경우, 음극을 콧구멍에 삽입하면 염색 결과가 개선될 수 있습니다.

염료의 극성이 확실하지 않은 경우 두 전극을 동시에 콧구멍에 배치하고 단일 전압 펄스 사이의 극성을 번갈아 가며 사용할 수 있습니다. 동물을 희생 제물로 바친 후 메스를 사용하여 비강, 후각 신경 및 후각 구를 포함하는 조직 블록을 해부합니다. 첫 번째 절개 부위를 왼쪽 콧구멍 가까이로 만들고 칼날을 앞으로 움직여 왼쪽 후각 신경과 구를 따라 텔뇌-이뇌 경계까지 자릅니다.

오른쪽에서도 마찬가지로 반복합니다. 다음으로, 텔뇌팔론(telencephalon) 뒤쪽에 최종 절단을 만들어 신경계의 나머지 부분으로부터 제제를 분리합니다. 후각 신경 사이에 두 개의 바늘을 삽입하여 조직 블록을 다시 고정합니다.

그런 다음 Frog Ringer 용액을 티슈에 한 방울 떨어뜨립니다. Ringer 용액으로 제제를 목욕시키면 해부 시 뇌 조직이 무너지는 것을 방지할 수 있습니다. 그 후, 축삭돌기 분류 영역과 후각구를 덮고 있는 수막을 세 번 절개하여 제거합니다.

조직 블록의 뒤쪽 가장자리에서 시작하여 후각 신경이 구로 들어가는 입구 지점까지 왼쪽 후각구를 따라 꼬리줄로 밀접하게 자릅니다. 오른쪽 반구에 대해 이 절차를 반복합니다. 그런 다음 집게로 수막을 들어 올리고 축삭 분류 영역에서 이전 수막과 수직으로 세 번째 절단을 만듭니다.

그런 다음 추가 처리 및 이미징을 위해 Frog Ringer로 채워진 기록 챔버로 샘플을 옮깁니다. 복부 쪽이 위를 향하고 있는지 확인하고 작은 백금 프레임 위에 걸쳐진 나일론 섬유 그물로 샘플을 고정합니다. 자극을 더 쉽게 가하려면 나일론 섬유 중 하나 위에 비강을 놓습니다.

이 절차에서는 마이크로피펫에 용액 10마이크로리터를 채우고 마이크로피펫을 튕겨 기포를 제거합니다. 다음으로, 마이크로피펫을 피펫 홀더에 장착합니다. 주사기 또는 공압 약물 배출 장치를 사용하여 수동으로 압력을 가할 수 있는지 확인하고 게이지로 적용된 압력을 모니터링합니다.

그런 다음 팁이 제제의 상부 방향을 가리키도록 피펫을 후각 전구 표면 위로 내립니다. 피펫이 막히는 것을 방지하기 위해 마이크로피펫에 작고 일정한 양압을 가하십시오. 마이크로피펫을 조직에 부드럽게 삽입하고 양압을 가합니다.

압력이 가해질 때 밝은 조명 아래에서 보이는 약간의 조직 움직임을 관찰하여 피펫의 유출을 확인합니다. 10분 로딩 후 가해진 압력을 0으로 낮추고 염색을 확인합니다. 염색된 영역의 크기는 크게 다르며 주입된 염료의 양 및 배출 부위의 위치와 같은 여러 매개변수에 따라 달라집니다.

좋은 염색은 약 100 마이크로 미터 x 100 마이크로 미터의 영역을 커버합니다. bolus loading하는 동안 시간 경과에 따른 승모판 세포체의 progressive dye loading을 모니터링합니다. 염색 강도 또는 염색된 승모세포의 수가 증가하지 않으면 피펫이 막혔는지 확인하고 필요한 경우 교체하십시오.

이 단계에서는 깨끗한 온도계 프로브를 튜브에 삽입하여 냉각된 Ringer의 온도를 모니터링합니다. 실험을 시작하기 전에 온도가 섭씨 1도 이하로 떨어질 때까지 기다리십시오. 다음으로, 퍼넬 어플리케이터를 사용하여 자극 링거에 동시에 자극을 전달하여 챔버의 물 흐름이 자극 용액 방출 중에 일정하고 중단되지 않도록 합니다.

그런 다음 원위 배출구가 후각 상피에서 1mm 미만 떨어져 있도록 깔때기를 배치합니다. 그런 다음 디지털 온도계에 연결된 니크롬 온도 센서를 상피와 깔때기 어플리케이터의 배출구 가까이에 놓습니다. 온도계 출력 포트를 컴퓨터에 연결하여 작은 온도 변동을 반영하는 전압 변화를 기록하고 시각적으로 표시합니다.

그 후, 이미지 획득을 시작하고 20-30초의 자극 간격으로 전자 피펫을 통해 200-400마이크로리터의 저온 Ringer, L-히스티딘 및 실온 Ringer를 순차적으로 적용합니다. 자극 애플리케이션을 더 잘 제어하려면 가능한 경우 선택한 이미징 설정에서 파이펫으로 보낸 트리거 신호로 자극을 해제합니다. 이 절차에서는 변수로 수집된 원시 데이터를 x, y, z, t 행렬로 구성된, x와 y는 측면 차원을, z는 축 방향을, t는 시간 경과를 나타내도록 MATLAB 사용자의 작업 공간에 불러옵니다.

그런 다음, MATLAB 명령줄에서 ACI를 호출합니다. UI에서 Prepare Data(데이터 준비)를 선택한 다음 데이터가 포함된 변수와 결과가 저장될 디렉터리를 선택합니다. UI에서 해당 슬라이더를 이동하여 측정된 z-레이어를 스크롤하여 표시된 분산 맵의 개요를 확인합니다.

그런 다음 UI에 ROI의 크기를 입력합니다. 승모세포체의 경우, ROI를 측면으로 약 10마이크로미터, 축 방향으로 5마이크로미터에 걸쳐 조정하십시오. 사구체의 경우 측면으로 20마이크로미터, 축 방향으로 10마이크로미터의 약간 더 높은 값이 적합합니다. 그런 다음, 감마 사구체를 포함하는 ROI를 선택하고 마우스 가운데 버튼으로 세포 또는 사구체의 중심을 클릭하여 주변 승모세포의 보이는 각 소마에 대한 추가 영역을 선택합니다.

그런 다음 기본 UI를 닫으면 모든 참조 추적에 대한 상관 관계 맵 계산이 트리거됩니다. 결과는 자동으로 저장되고 표시됩니다. 이 이미지는 작은 클러스터에서 끝나는 ORN의 축삭돌기가 칼슘에 민감하지 않은 염료인 Alexa 647 Dextran을 사용한 전기천공에 의해 염색되었음을 보여줍니다.

점선은 감마 사구체의 윤곽을 나타냅니다. 여기에 표시된 것은 칼슘에 민감한 염료인 Fluo-8 AM으로 볼루스를 로딩한 후 두 번째 측정 채널에서 동일한 영역의 이미지입니다. 일부 승모세포체(mitral cell somata)가 보였지만 대비는 제한적이었습니다. 활성 상관 관계 이미징을 위해 두 개의 반응 추적이 표시되었으며, 추적 아래의 파란색, 빨간색 및 검은색 막대는 각각 콜드 링거, 10마이크로몰에서 히스티딘 및 실온 링거를 음성 대조군으로 적용

주로 콜드 링거에 반응하는 강조 표시된 영역의 추적에 대한 ACI 결과가 여기에 표시됩니다. 다음은 주로 히스티딘에 반응하는 강조 표시된 영역의 추적에 대한 ACI 결과입니다. 이 그림에서는 두 ACI 맵의 오버레이를 보여 줍니다.

히스티딘(histidine)에 반응하는 승모세포(mitral cell)와 신경분포된 사구체(neurovated glomerulus)는 감마 사구체(gamma glomerulus)의 열에 민감한 승모세포(thermosensitive mitral cell)와 쉽게 구별할 수 있었습니다. 이 절차는 열민감성과 화학민감성이 후각구의 은밀하고 중복된 신경 네트워크에 있는지 여부를 조사하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 동물의 세포 전기천공법, 볼루스 로딩 및 ACI라고도 하는 활동 상관 관계 이미징을 사용하여 후각구의 온도 처리를 기록하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

볼루스 로딩 및 ACI는 수십 개의 뉴런의 활동과 연결성을 3D로 관찰하고 비교할 수 있는 강력한 도구로, 다양한 뇌 영역과 뉴런 네트워크에 쉽게 적용할 수 있습니다.