전혈에서 고감도 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치

이 절차의 전반적인 목표는 천연 방적 나노섬유를 사용하여 ELISA의 검출 감도를 향상시키는 것입니다. 이 동영상은 30분 이내에 10마이크로리터의 전혈 샘플에서 단백질의 펨토몰라 검출 감도를 달성하는 방법을 보여줍니다. lab-on-a-disc 플랫폼에서는 원심력을 사용하여 액체를 챔버를 통해 액체를 전달하고 전체 공정이 완전히 자동화됩니다.

검출 감도는 나노 섬유의 통합에 의해 크게 향상될 수 있습니다. 그러나 문제는 나노 섬유가 매우 약하고 다루기 어렵다는 것입니다. 이 비디오에서는 깨지기 쉬운 이산화티타늄 나노섬유 매트를 플라스틱 디스크에 부착하는 간단한 과정을 소개합니다.

전기 방사에 의해 실리콘 기판에 이산화 티타늄 나노 섬유 매트를 제조하기 위해, 실리콘 기판을 먼저 실란화하고 PDMS로 코팅 한 다음 사전 경화시킵니다. 그런 다음 나노섬유 매트를 이 사전 경화된 PDMS로 옮기고 이 제품을 펀칭하여 부착을 위한 원형 조각을 생성합니다. PDMS 한 방울을 접착제로 반응 챔버에 코팅하고 원형 조각을 챔버 바닥에 부착합니다.

그런 다음 오븐에서 PDMS를 경화시킵니다. 마지막으로, 디스크 레이어를 ELISA를 위한 하나의 완전한 장치로 조립합니다. 이 나노섬유 전달 기술을 통해 나노섬유의 높은 표면적을 생물 분석에 활용할 수 있습니다.

원심 미계통 장치는 ELISA에 필요한 모든 프로세스의 완전한 통합 및 자동화를 제공합니다. 다른 기존하는 방법에 이 기술의 주요 이점은 단지 10 마이크로리터의 전혈에서 단백질의 펨토몰라 농도를 검출할 수 있었다 입니다. 함께 제공되는 테스트 프로토콜에 설명된 대로 전구체 용액을 준비합니다.

그런 다음 전기 스피너에 용액을 넣고 최적의 조건을 사용하여 전기 방사로 나노 섬유를 제작합니다. 폴리머 나노섬유 매트가 준비되면 진공 상태의 용광로에서 소성합니다. 소성 후, 이산화 티타늄 나노 섬유 매트가 최종적으로 준비됩니다.

SOLIDWORKS와 같은 3D 설계 소프트웨어를 사용하여 미세계통 레이아웃을 준비하고 설계를 CNC 밀링 머신으로 전송합니다. CNC 밀링 머신을 작동하여 채널과 챔버가 있는 디스크를 제작합니다. 이제 디스크와 나노섬유 매트를 통합할 준비가 되었습니다.

진공 챔버, 실리콘 기판 및 플루오로실란을 준비합니다. 진공 상태에서 30분 동안 플루오로실란으로 실리콘 기판을 실란화합니다. 경화제와 프리폴리머를 10:1 비율로 준비하여 게스트 PDMS를 준비하고, 650RPM으로 실란화된 실리콘 기판 위에 60초 동안 스핀 코트를 합니다.

실란화된 웨이퍼에 코팅된 PDMS를 섭씨 65도에서 10분 동안 경화하여 접착시킵니다. 이제 유리 슬라이드와 같은 평평한 물체를 사용하여 적절한 압력을 가하여 나노섬유 매트를 PDMS 코팅 실리콘으로 옮깁니다. 접착제 PDMS를 완전히 경화시키기 위해 섭씨 80도에서 1시간 동안 샘플을 굽습니다.

PDMS 층에 부착된 나노섬유 매트에 에탄올 몇 방울을 떨어뜨리고 PunchIt을 사용하여 직경 6mm의 구멍을 만듭니다. 그런 다음 실리콘 기판에서 PDMS에 부착된 펀칭된 나노섬유 매트를 벗겨냅니다. 다음으로, 디스크의 결합 반응 챔버를 약 20마이크로리터의 PDMS 혼합물로 코팅하고 PDMS에 부착된 나노 섬유를 챔버에 놓습니다.

그런 다음 나노섬유 매트 통합 디스크를 섭씨 80도에서 1시간 동안 배양합니다. 에탄올에서 GPDES의 부피 용액 당 1 % 부피를 준비합니다. 그런 다음 디스크의 나노 섬유를 산소 플라즈마로 처리합니다.

각 나노섬유 매트에 100마이크로리터의 GPDES 용액을 분배하고 밀봉된 용기에서 2시간 동안 실온에서 배양합니다. 배양 후 와이퍼의 디스크를 두드려 GPDES 용액을 제거합니다. 에탄올로 씻고 제거한 후 섭씨 80도에서 1시간 동안 굽습니다.

굽고 나면 에탄올로 씻고 두드려 제거합니다. 이 과정을 반복하고 질소 흐름으로 불어 건조시킵니다. 항체 고정을 위해 희석된 포획된 항체 용액을 분배합니다.

디스크를 가습 챔버에 보관하고 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 세척 버퍼로 남은 용액을 씻어냅니다. 이제 양면 접착 테이프를 사용하여 디스크를 조립합니다.

층을 완전한 디스크로 조립하기 위해 적절한 압력을 가합니다.결합 반응 챔버를 차단 버퍼로 채우고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 세척 버퍼로 두 번 세척하고 디스크를 사용할 때까지 섭씨 40도에서 보관하십시오.

시약, 세척 완충액 및 10마이크로리터의 전혈을 시약과 시료 챔버에 로드합니다. 자동 면역 분석을 위해 맞춤형 시각화 기계에 디스크를 넣습니다. 시각화 시스템에는 자동 디스크 작동을 위한 컴퓨터에 연결된 로터와 스트로브 라이트 및 이미지 촬영을 위한 CCD 카메라가 포함되어 있습니다.

3, 600RPM으로 60초 동안 디스크를 돌려 적혈구를 분리합니다. 혈장과 검출 항체를 혼합합니다. 혼합물을 이산화 티타늄 나노 섬유 매트와 통합 된 반응 챔버로 옮깁니다.

면역반응 후, 세척 버퍼를 반응 챔버로 옮겨 나노 섬유를 세척합니다. 그런 다음, 화학발광 기질 용액을 결합 반응 챔버로 옮기고 1분 동안 혼합 모드에서 배양합니다. 마지막으로, 반응된 기질 용액을 검출 챔버로 옮깁니다.

모든 반응이 완료되면 디스크를 검출 시스템으로 옮기고 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 화학발광 신호를 판독합니다. 디스크 작동과 감지 시스템을 단일 플랫폼에 통합할 수 있습니다. 전압과 플루오레이트를 최적화하여 이 SEM 이미지에 표시된 것처럼 균일한 나노섬유 매트를 얻었습니다.

PDMS 경화 시간을 최적화하기 위해 접착력을 측정했습니다. 너무 짧으면 나노섬유 매트가 PDMS에 끼워지거나 너무 길면 벗겨집니다. 최적화 후 나노섬유 매트를 PDMS에 안정적으로 부착했습니다.

두 플랫폼에서 C-반응성 단백질 검출을 위한 선형 범위가 이 그래프에 나와 있습니다. 디스크에 대한 나노섬유 무결성 실험실을 사용하여 단 10마이크로리터의 혈청에서 30분 이내에 C 반응성 단백질의 검출 감도를 크게 향상시킬 수 있었습니다. 96웰 플레이트 기반 ELISA와 같이 현재 사용 가능한 기술은 더 많은 시료 부피와 더 긴 검출 시간을 필요로 합니다.

전반적으로 나노섬유 통합 디스크 기반 ELISA는 6개의 C 반응성 단백질의 펨토몰 검출 한계와 함께 6배의 광범위한 동적 범위를 보여주었습니다. 원판에서 통합된 nanofiber에 의해 제공된 높은 표면적에 의해 원조된 이 탐지 감도는 2, 000의 펨토몰에 한정되었던 전통적인 ELISA의 그것을 초과했다. 이 비디오를 시청한 후 원심 미세계통 장치를 준비하는 방법, 위상 나노섬유를 통합하는 방법 및 ELISA를 사용하여 단백질 검출을 수행하는 방법을 잘 이해하셨기를 바랍니다.

이 기술은 매우 적은 양의 생물학적 샘플에서 낮은 결합 단백질을 검출하는 데 유용할 수 있습니다.