Name: 전혈에서 고감도 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 배우세요 전혈에서 펨토몰 농도 단백질을 30분 내에 검출하는 완전 자동화 원심 미세유체 장치 기법을. 나노섬유 통합 디스크 플랫폼을 활용하여 고감도 진단 분석을 수행하는 방법입니다.

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이 작품은 한국 연구 재단 (NRF) 보조금 (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), 한국 정부에 의해 투자 한국의 의료 기술 R &amp; D 프로젝트, 보건 복지부 (A121994)와 IBS-R020-D1의 정부에서 보조금에 의해 지원되었다.

주 : 혈액 건강한 사람에서 도출하고, 혈액 수집 튜브에 수집 하였다. 서면 동의서는 모든 자원 봉사자들로부터 얻은 것입니다. 이산화 티탄 NF 매트 1. 제작 <ol><li> 전구체 용액 (22)의 제조 <ol><li> 에탄올 (99.9 %, 3 ml) 및 빙초산 (3 mL)을 혼합하여 티타늄 테트라 이소 프로 폭 사이드 (TTIP) 1.5 g을 용해시키고, 자기 교반기에서 30 분 동안 RT에서의 수용액 (25 ° C)을 혼합한다. </li><li> 에탄올 (99.9 %)의 3.64 g의 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP)의 11 중량 %를 용해시키고, 핫 플레이트, 자기 교반기를 사용하여 1 시간 동안 65 ° C에서 상기 용액을 교반한다. </li><li> 결합 및 핫 플레이트 자석 교반기 4 시간 동안 65 ° C에서 두 솔루션을 저어. </li></ol></li><li> 전기 방사 <ol><li> 200 μm의 내측 diame의 스테인리스 바늘에 연결된 주사기로 제조 된 용액을로드터. 플런저를 제거한 후, 주사기에 직접 용액을 붓는다. </li><li> 높은 DC 전압 (15 kV로)에 접지 된 기판 상에 배치 된 실리콘 웨이퍼 상에 10 분 동안 0.3 ml / hr의 유량 (2cm X 2cm)에 항상 용액을 소개한다. 전기 방사 중에 니들 10cm에 접지 기판 사이의 거리를 설정한다. </li></ol></li><li> NF 개의 매트의 하소 <ol><li> 노에서 NF 매트를 놓고 고진공 조건 (5 × 10-5 토르)하에 3 ℃ / 분으로 램핑 속도로 500 ℃까지 온도를 증가시킨다. </li><li> 3 시간 동안 500 ° C의 온도를 유지한다. 노의 RT (25 °의 C)로 샘플의 온도를 냉각. </li></ol></li></ol> 원심 미세 유체 디스크에 티오 2. 통합이 NF 매트 <ol><li> 디스크의 제조 <ol><li> 3 차원 설계 소프트웨어 (예를 들면, 솔을 사용하여idWorks 또는) 유사한 디스크의 각 층의 챔버, 채널 또는 밸브를 묘사한다. 코드 생성 소프트웨어 (예를 들어, Edgecam 또는 유사)를 사용하여 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 코드 설계 파일을 변환합니다. 상기 명령에 따라 소프트웨어를 사용 설명서 23,24 참고.이 장치에 사용되는 일반적인 채널 치수 X 0.3 mm (폭 X 깊이) 1.0 mm이다. </li><li> (CNC 밀링 머신의 운영 소프트웨어를 열고 예., DeskCNC 또는 이와 유사한 것) 및 운영 소프트웨어 CNC 코드를로드하고 순서대로 다음을 클릭합니다 : &quot;AUTO&quot;-&gt; &quot;G CODE OPEN을&quot;-&gt; 생성 된 CNC 코드를 선택합니다. </li><li> CNC에 밀링 머신의 PC 판을 부착 : 디스크 층에 대한 상위 계층과 5mm의 PC 판을위한 1mm의 PC 판을 사용합니다. &quot;시작&quot;버튼을 클릭하여 디스크의 각 층을 절단하는 CNC 밀링 머신을 실행합니다. </li></ol></li><li> 디스크 상에 이산화 티탄 NF 매트의 전송<ol><li> 실리콘 기판 40 μL (트리 데카 -1,1,2,2- tetrahydrooctyl)에서 30 분 동안 진공 하에서 진공 챔버 -1- 트리클로로 실란을 함유하는 작은 페트리 접시를 놓는다. 플루오로 실란이 증발하여 기판에 도포 얻는다. </li><li> 진공 챔버에서 탈기 한 비율 10 : 경화제로 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 예비 중합체를 혼합한다. 스핀 코트를 60 초 동안 650 rpm으로 실리콘 기판 상에 PDMS. </li><li> 10 분 점착성 상태를 달성하기 위해 65 ° C의 오븐에서 실리콘 기판 상에 코팅 된 PDMS 큐어. 주 : 경화 시간은 환경 조건에 따라 변화 될 수 있고, 접착력은 레오 미터를 사용하여 점착성 시험에 의해 시험 될 수있다. </li><li> 트위터를 사용하여 PDMS 코팅 된 실리콘에 전기 방사 및 소성에 의해 제조 된 이산화 티탄 NF 매트를 전송합니다. 그런 다음, 수동 (유리 슬라이드, 예.) 평면 객체에 전송 된 이산화 티탄 NF 매트에 균일 한 압력을 적용하고 개체를 제거합니다. 놓다4 시간 동안 65 ℃에서 또는 1 시간 동안 80 ° C의 오븐에서 샘플이 완전히 PDMS 층을 경화한다. </li><li> 20 μL를 PDMS / 경화제 혼합물과 디스크에 코트 결합 반응 챔버 (10 : 1), 접착제 층 역할을하는 디스크에 이산화 티탄 NF 매트를 부착합니다. </li><li> PDMS의 층에 이산화 티탄 NF 매트에 에탄올 (99.9 %)의 50 μL를 분배 6 mm 직경의 펀치 구멍과 NF 매트를 절단하고, 20 μL로 코팅 된 결합 반응 챔버 이산화 티탄 NF 매트를 절단 전송 이전 단계에서 PDMS의. 참고 :이 단계에서, 에탄올 Si 기판에서 절단 이산화 티탄 NF 매트를 분리하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 1 시간 완전 경화 PDMS를 4 시간 동안 80 ° C에서 65 ° C의 오븐에서 이산화 티탄 NF 매트 내장형 디스크 부화. </li></ol></li><li> 디스크상의 이산화 티탄 NF 매트의 표면 개질 <ol><li> 피에탄올 (3- 글리시 독시) methyldiethoxy 실란 (GPDES)의 repare 1 % v / V를 용액 (99.9 %). </li><li> 140 W, 180 초 동안 50 sccm의 산소 흐름에 산소 플라즈마와 이산화 티탄 NF 매트 통합 된 디스크를 취급합니다. 각각의 나노 섬유 매트에 GPDES 용액 100 μl를 분배하고 2 시간 동안 RT (25 °에 C)에 품어. </li><li> 세척 병을 사용하여 에탄올 (99.9 %)을 분배하여 기판 간단히 세척 한 후 디스크를 반전하고 깨끗한 대해 그것을 닦아 블로 팅에 의해 완전히 에탄올을 제거합니다. 1 시간 동안 80 ℃에서 경화. 상술 한 바와 같이 물리적으로 흡착 바운드 GPDES 분자를 제거하고, 동일한 방식으로 에탄올 (99.9 %)로 두 번 세척 하였다. </li><li> 건식 진공 상태에서, 질소 기류로 바람을 불어 건조. 주 : 디스크를 사용할 때까지 실온 (25 ℃)에서 밀폐 용기에 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 표면에 항체의 고정화 <ol><li> 포획 항체 200 μg의 / ㎖의 용액 (마우스 모노클로 날 항 만들기인간 hsCRP 또는 인산염 완충 식염수 (PBS) 완충액 (pH 7.4)로 항체를 희석하여 단일 클론 마우스 항 cTnI는). 마이크로 피펫을 사용하여 디스크의 각 NF 매트 상 용액 5 μL를 분배. 항체에 대한 자세한 내용은 자료의 목록을 참조하십시오. </li><li> 가습 실에서 디스크를 유지하고 4 시간 동안 37 ° C에서 품어. 0.1 % BSA-PBS 버퍼와 NF 매트 코팅 된 항체를 씻으십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 세척 완충액 100 ㎕와 챔버를 채우기, 흡입 또는 경사에 의해 버퍼를 제거합니다. 마지막으로, 디스크를 반전하고 깨끗한 닦아에 대해 그것을 가릴 다음 디스크를 조립한다. </li></ol></li><li> 디스크 어셈블리 <ol><li> 캐드 프로그램 (예 AutoCAD의 또는 유사한)를 사용하여 양면 접착 테이프, 디스크의 디자인을 그린다. 커팅 플로터에 CAD 설계를 넣습니다. </li><li> 커팅 플로터를 사용하여 양면 접착 테이프를 잘라. 이중 접착 테이프의 한 보호 층을 벗겨과 내가 첨부디스크 층의 상단에 t. 다른 보호 층을 벗겨 디스크 상에 상부 층을 연결합니다. </li><li> 프레스 기계에 미리 조립 된 디스크를로드하고 정확하게 각 밸브, 채널 및 챔버를 연결하는 각 층에 정렬 마크를 사용하여 상단 / 접착제 / 디스크 층을 맞 춥니 다. 프레스 기계를 사용하여 균일 한 압력을 적용합니다. </li></ol></li></ol> 3. 면역 <ol><li> 마이크로 피펫을 이용하여 1 % BSA-PBS 완충액 챔버를 채우고, 1 시간 동안 37 ° C에서 디스크를 배양한다. 마이크로 피펫을 사용하여 흡인하여 버퍼를 제거합니다. 미 반응 사이트를 차단하고, 디스크에 단백질의 비특이적 흡착을 감소시키기 위해이 단계를 수행한다. </li><li> 충전 및 마이크로 피펫을 사용하여 실을 흡입하여 0.1 % BSA-PBS로 두 번 세척 하였다. 참고 :이 단계에서 디스크를 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> micropipett을 사용하여 디스크에 CRP 검출을위한 항원 아군 전체 혈액 또는 CRP 무 혈청로드 10 μL이자형. 교정 그래프를 만들기 위해, 100ng의 / ㎖ 1 pg / ml이다에서 CRP 농도를 사용한다; cTnI는 10 pg / ml 인 내지 100 ng / ml이되게 준비 하였다. 참고 μM의 범위이다 전혈에서 CRP의 높은 수준으로 인해 CRP 무 혈청 장치의 낮은 검출 한계를 보여주기 위해 사용되었다. </li><li> 적혈구를 분리하는 60 초 동안 3600 RPM (XG 391)에서 디스크를 스핀. </li><li> 개방 밸브 레이저 조사에 의해 1 번, 그리고 전사 3 초 동안 2400 rpm으로 디스크를 회전시켜 HRP가 결합 된 항체를 검출 8 μL를 포함하는 챔버에 뜨는 플라즈마 4 μL. 주 :. 밸브 활성화 및 디스크 동작의 시각화를위한 일반적인 프로세스는 이전의 보고서에 상세히 설명 21 </li><li> 단백질 검출 항체의 결합을 5 초 동안 혼합 모드 (15 Hz에서의 -1, 15 °)를 적용합니다. </li><li> 오픈 밸브 # 2, 결합 반응 챔버 6 단계에서 제조 된 혼합물을 트랜스퍼 (2,400 RPM3 초). 이어서, 혼합물을 이산화 티탄 연맹에 결합하는 항체 사이의 면역 반응을 달성하기 위해 20 분 동안 혼합 모드 (60 Hz에서의 -1,2- °)을 적용한다. 상기 반응 개방 밸브 # 3 후 폐 챔버 (2400 RPM, 10 초)에 잔류 혼합물을 옮긴다. </li><li> 밸브 # 4를 열고 디스크 (2400 rpm으로 4 초)을 회전시켜 결합 반응 챔버의 세정 완충액 (600 μL)를 옮긴다. 이어서 챔버 내의 이산화 티탄 연맹 씻어 120 초 동안 혼합 모드 (30 Hz에서의 -1, 30 °)를 적용한다. </li><li> 단계 3.8의 동일한 조건에 따라 두 번 더 이산화 티탄 연맹을 세척하고, 20 초 동안 2,400 rpm에서 디스크를 회전시켜 완전히 잔류 세척 버퍼를 제거합니다. 그리고, 밸브 # 5를 닫는다. </li><li> 화학 발광 반응을위한 밸브 # 6 및 방사를 개방함으로써 결합 반응 챔버에 화학 발광 기질 용액을 전송 한 후 1 분 동안 혼합 모드 (30 Hz에서의 -1,2- °)를 적용이후 10 초 동안 2,400 rpm에서 디스크. </li><li> 밸브를 개방 # 7, 10 초 동안 2400 rpm으로 디스크를 회전시켜 상기 검출 챔버로 반응 기질 용액을 전송. </li><li> 광전자 증 배관 (PMT) 모듈을 갖춘 검출 시스템을 사용하여 반응 기질 용액에서 화학 발광 신호를 측정한다. 주 : 스텝 모터, 현미경 성분 변환 단계, 및 상업적으로 입수 한 PMT : 검출 계는 다음과 같은 부품을 사용하여 맞춤형 기계이다. 현미경 부품, 스텝 모터 장치를 유지하도록 조립되고, 모터는 디스크를 회전시킬 수있다. 검출은 현미경 부에 고정 된 PMT에 의해 수행되고, 이는 상기 장치의 검출 챔버 위에 배치된다. 스텝 모터를 조작함으로써, 검출 챔버 바로 PMT의 검출 영역 아래에 정렬된다. </li></ol>

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이산화 티탄 NF 통합 된 디스크에 대한 분석은 혈액의 매우 낮은 볼륨에 존재하는 낮은 풍부한 단백질의 고감도 검출을위한 신속하고 저렴하고 편리한 기술이다. 이 기술은 적은 양의 샘플 (10 μL)를 사용하는 장점을 가지며, 동시에 다수의 샘플 분석을위한 의무이다. 이것은 다중 면역 장치로서 큰 잠재력을 제공한다. 상기 장치는 통상적 인 ELISA를에 필요한 혈장 분리, 같은 시료의 전처리 단계를 필요로하지 않는 추가적인 이점을 갖는다. 또한, 상기 장치로 인해 미리 설계된 챔버, 채널, 밸브 전체 면역 절차 (예를 들면, 혼합, 세척, 결합 등)을 자동으로 수행 할 수있다. 접착제를 사용하는 대신 제분 수동 조립 또한 상용화 디스크의 제조 방법을 이용하여 (예를 들어, 사출 성형, UV / 초음파 / 열 접착) 분석 디바이스의 제조의 전체 공정은 수 있습니다자동화. 또한, 여기에 제시된 전사 인쇄 방법은, 얇은 접착제 PD...

질병 진단을위한 여러 플랫폼 1,2- 예컨대 나노 와이어, 나노 입자 (3), (4) 나노 튜브 (5)와 나노 파이버 (NFS) 6-8과 같은 나노 재료에 기초하여 개발되었다. 이 나노 물질은 독특한 물리 화학적 특성으로 인해 매우 민감한 생물 검정을위한 새로운 기술의 디자인 적으로도 뛰어난 전망을 제공합니다. 예를 들어, 메조 포러스 산화 아연 나노 유방암 바이오 마커의 펨토 몰 민감한 검출을 위해 사용되었다. 구 최근 화학적 안정성을 고려하여 생체 시료 애플리케이션 10 탐구되었다 티탄 (TiO2), 이산화에 기초하여 나노 물질을 11 무시할 단백질 변성 12 및 또한 생체 적합성.도 13은 이산화 티탄의 표면에 수산기 화학적 변형 및 생체 분자의 공유 결합을 용이하게한다. 14,15 무늬 이산화 티탄 생N 막 16 이산화 티탄 (17) 표면적이 증가하여 표적 단백질의 검출 감도를 향상시키는 데에 이용 된 나노 튜브; 그러나, 제조 공정이 다소 복잡하고 값 비싼 장비를 필요로한다. 한편, 전기 방사 NFS가 간단하고 저렴한 제조 공정뿐만 아니라 그들의 높은 표면적 주목 받고; 18,19 아직 상기 전기 방사 이산화 티탄 NF 매트 취약한 느슨한 특성 다루기가 어렵고 미세 유체 장치와 통합 할 수 있습니다. 6,20을 따라서, 이산화 티탄 NF 매트는 거의, 생체 시료 응용 프로그램에서 거친 세척 조건을 필요로 특히 활용되지 않았다. 본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 얇은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 접착제 층을 이용하여 임의의 피 처리 기판의 표면에 매트 NF는 전기 방사를 전송하는 새로운 기술을 개발 하였다. 작고에hermore, 우리는 성공적으로 폴리 카보네이트 (PC)로 이루어진 원심 미세 유체 소자로 전기 방사 티오 NF는 매트 (2)의 적분을 보여왔다. 이 장치를 사용하여, C 반응성 단백질의 민감한 높은 완전 자동화 된, 통합 검색 (CRP)뿐만 아니라 심장 트로포 닌 I (cTnI는)는 전체 혈액의 10 μL에서 30 분 이내에 달성 하였다. (21)로 인해 결합에 는 NFS와 원심 플랫폼의 특성의 장점은 분석은 검출 하한 100 ng를 / ㎖ (0.8 ~ PM) 1 pg / ml 인 (~ 8 FM)에서 크기의 여섯 주문의 넓은 동적 범위를 전시 CRP (37) PG / ㎖ (~ 오후 1시 5분)의 검출 한계 100ng의 / ㎖ (~ 4 ㎚) 10 pg / ml 인 (0.4 ~ PM)의 동적 범위의 0.8 pg / ml이다 (~ 6 FM)의 cTnI는합니다. 이러한 검출 한계는 300 ~되고, 20 배, 대응하는 종래의 ELISA 결과와 비교하여 낮은. 이 기술은 적절한 항체 모든 표적 단백질의 검출에 적용될 수있다. 전반적으로,이 장치 공동예를 들면, 전혈을 10 μl를 그것은 생물학적 샘플의 극소량에서조차 좋은 감도로 표적 단백질의 드문 양을 검출 할 수 있기 때문에 ULD은 체외 진단 및 생화학 적 분석에 크게 기여한다. 우리는이 연구에서 ELISA를 사용하여 혈청 단백질 검출을 증명하지만, 미세 유체 소자와 전기 방사의 NFS 전사 통합 기술은 더 광범위하게 높은 검출 감도를위한 큰 표면적을 필요로하는 다른 생화학 적 반응에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Si 웨이퍼</td><td>LG SILTRON</td><td>광택 웨이퍼, 테스트 등급</td><td>직경 (mm) = 150, 방향 = < 100>, 도펀트 = 붕소, RES(옴-cm) = 1 - 30, 두께(&mu; m) = 650 - 700</td></tr><tr><td>폴리카보네이트(PC)&nbsp;</td><td>대동 플라스틱</td><td>PCS#6900</td><td>두께(mm) = 1 및 5&nbsp;</td></tr><tr><td>티타늄 테트라이소프로폭사이드, 98%,</td> <td>시그마-알드리치</td><td>205273</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈, Mw = 1,300,000</td><td>시그마-알드리치</td><td>437190</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>무수 에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)-1-트리클로로실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 및 경화제</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>GPDES</td><td>Gelest Inc</td><td>SIG5832.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>J T 베이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FE-SEM</td><td>FEI</td><td>노바 나노SEM</td><td></td></tr><tr><td>X선 광전자 분광법</td><td>ThermoFisher</td><td>K-alpha</td><td></td></tr><tr><td>3D 모델링 기계</td><td>M& I CNC Lab, 한국</td><td></td><td>CNC 밀링 머신</td></tr><tr><td>왁스 디스펜싱 기계</td><td>한라정밀 엔지니어링 (주), 한국</td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>양면 접착 테이프</td><td>FLEXcon, 미국</td><td>DFM 200 클리어 150 POLY H-9 V-95</td><td></td></tr><tr><td>커팅 플로터</td><td>Graphtec Corporation, 일본</td><td>Graphtec CE3000-60 MK2</td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>MIDAS</td><td>SPIN-3000D</td><td></td></tr><tr><td>용광로 (하소)</td><td>R. D. WEBB COMPANY</td><td>WEBB 99</td><td></td></tr><tr><td>레오미터 (택 테스트)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Haake MARS&nbsp; III - ORM 패키지</td><td></td></tr><tr><td>산소 플라즈마 시스템</td><td>FEMTO</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>단클론 마우스 antihuman hsCRP</td><td>Hytest Ltd., 핀란드</td><td>4C28</td><td>(클론 # C5)</td></tr><tr><td>모노클로날 마우스 anti-cTnI</td><td>Hytest Ltd., 핀란드</td><td>4T21</td><td>(클론 # 19C7)</td></tr><tr><td>HRP 활용 염소 polyclonal anti-hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab19175</td><td></td></tr><tr><td>HRP 복합 마우스 단클론 항-cTnI</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab24460</td><td>(클론 # 16A11)</td></tr><tr><td>hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab111647</td><td></td></tr><tr><td>cTnI</td><td>Fitzgerald, MA</td><td>30-AT43</td><td></td></tr><tr><td>소 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Amresco</td><td>Inc E404</td><td></td></tr><tr><td>혈액 수집 튜브</td><td>BD vacutainer</td><td>367844</td><td>K2 EDTA 7.2 mg plus 혈액 수집 튜브</td></tr><tr><td>SuperSignal ELISA 펨토</td><td>Invitrogen</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>모듈식 다중 라벨 플레이트 리더</td><td>Perkin Elmer Envision</td><td>2104</td><td></td></tr><tr><td>디스크 작동 기계</td><td>Hanra Precision Eng. Co., Ltd., 한국</td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>광전자 증배관(PMT)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>H1189-210</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk</td><td>버전 2012</td><td>디자인 소프트웨어</td></tr><tr><td>SolidWorks 3D CAD 소프트웨어&nbsp;</td><td>솔리드웍스</td><td>버전 2013</td><td>3D 디자인 소프트웨어,</td></tr> <tr><td>Edgecam</td><td>Vero 소프트웨어</td><td>버전 2009.01.06928</td><td>코드 생성 소프트웨어</td></tr><tr><td>DeskCNC</td><td>Carken Co.</td><td>버전 2.0.2.18</td><td>CNC 밀링 머신 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

전혈에서 고감도 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 생물학적 샘플에서 소량의 단백질을 검출할 수 있는 유망한 방법입니다. 시료량 및 분석 시간 단축을 위한 플랫폼과 완전 자동화를 제공하는 장치는 현장 진단에 잠재적으로 사용할 수 있도록 필요합니다. 최근에는 TiO2 나노섬유성(NF) 매트로 구성된 랩온-어디스크(lab-on-a-disc)를 활용하여 혈청 단백질, C-반응성 단백질(CRP) 및 심장 트로포닌 I(cTnI)의 초고감도 검출을 입증했습니다. 30분 안에 소량의 전혈에서 펨토 어금니(fM) 감지 감도로 넓은 동적 범위를 보여주었습니다. 이 장치는 혈액 분리, 계량, 혼합 및 세척을 위한 여러 구성 요소로 구성되어 있으며, 적은 시료 부피로 인한 감도 향상을 위해 자동화되어 있습니다. 여기, 비디오 데모에서 우리는 NF 및 디스크 제작, 통합 및 작동에 대한 실험 프로토콜과 노하우를 다음 순서로 보여줍니다 : TiO2 NF mat 준비 프로세스; TiO2 NF 매트를 디스크에 전사 인쇄; 면역 반응, 디스크 조립 및 작동을 위한 표면 개질; On-Disc 검출 및 면역 분석에 대한 대표 결과. 이 장치를 사용하면 샘플과 시약의 소비를 최소화하면서 다중화 분석이 가능합니다. 장점을 감안할 때, 이 장치는 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있어야 하며 부족한 단백질의 분석을 용이하게 하는 데 도움이 되는 것으로 입증되었습니다.

이 프로토콜, 높은 감도를 제조 하였다으로 전체 혈액에서 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치를 사용. 이산화 티탄 NF 매트는 전기 방사 및 소성 공정에 의해 제조 하였다. 이러한 유량, 전압 및 회전 시간 등의 조건을 전기 방사 원하는 직경, 형태 및 두께는 NFS를 제조하기 위해 최적화되었다. 조건이 최적화되지 않은 경우는 NFS 형성의 질이 저하되었다. 특히 연맹은 낮은 전압 (kV의 5)의 고분자 용액으로부터 방사되지하였고, 전압이 높을 때 (&gt; 20 kV로)을 세분화 하였다. 마찬가지로, 회전 시간은 적절한 밀도, 너무 희소하지 (1 분) 또는 너무 조밀 한 (30 분)와 연맹의 제조에 중요했다. 또한, 높은 유속에 의한 비드의 형성을 방지하기 위해 유속을 조작 하였다. 그래서, 1-15 kV의인가 전압의 10 분 전기 방사 시간 및 0.3 ml의 용 hr의 유량 <sup&gt; -1 형태 얻어진 연맹의 두께 <st...

이 프로토콜은 30분 이내에 10μL의 전혈에서 단백질의 펨토 어금니 감지 감도를 달성하는 방법을 보여줍니다. 이는 랩온-어-디스크(lab-on-a-disc)에 통합된 전기방사 나노섬유질 매트를 사용하여 달성할 수 있으며, 이는 높은 표면적과 향상된 신호 대 잡음비를 위한 효과적인 혼합 및 세척을 제공합니다.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

이 절차의 전반적인 목표는 천연 방적 나노섬유를 사용하여 ELISA의 검출 감도를 향상시키는 것입니다. 이 동영상은 30분 이내에 10마이크로리터의 전혈 샘플에서 단백질의 펨토몰라 검출 감도를 달성하는 방법을 보여줍니다. lab-on-a-disc 플랫폼에서는 원심력을 사용하여 액체를 챔버를 통해 액체를 전달하고 전체 공정이 완전히 자동화됩니다.검출 감도는 나노 섬유의 통합에 의해 크게 향상될 수 있습니다. 그러나 문제는 나노 섬유가 매우 약하고 다루기 어렵다는 것입니다. 이 비디오에서는 깨지기 쉬운 이산화티타늄 나노섬유 매트를 플라스틱 디스크에 부착하는 간단한 과정을 소개합니다.전기 방사에 의해 실리콘 기판에 이산화 티타늄 나노 섬유 매트를 제조하기 위해, 실리콘 기판을 먼저 실란화하고 PDMS로 코팅 한 다음 사전 경화시킵니다. 그런 다음 나노섬유 매트를 이 사전 경화된 PDMS로 옮기고 이 제품을 펀칭하여 부착을 위한 원형 조각을 생성합니다. PDMS 한 방울을 접착제로 반응 챔버에 코팅하고 원형 조각을 챔버 바닥에 부착합니다.그런 다음 오븐에서 PDMS를 경화시킵니다. 마지막으로, 디스크 레이어를 ELISA를 위한 하나의 완전한 장치로 조립합니다. 이 나노섬유 전달 기술을 통해 나노섬유의 높은 표면적을 생물 분석에 활용할 수 있습니다.원심 미계통 장치는 ELISA에 필요한 모든 프로세스의 완전한 통합 및 자동화를 제공합니다. 다른 기존하는 방법에 이 기술의 주요 이점은 단지 10 마이크로리터의 전혈에서 단백질의 펨토몰라 농도를 검출할 수 있었다 입니다. 함께 제공되는 테스트 프로토콜에 설명된 대로 전구체 용액을 준비합니다.그런 다음 전기 스피너에 용액을 넣고 최적의 조건을 사용하여 전기 방사로 나노 섬유를 제작합니다. 폴리머 나노섬유 매트가 준비되면 진공 상태의 용광로에서 소성합니다. 소성 후, 이산화 티타늄 나노 섬유 매트가 최종적으로 준비됩니다.SOLIDWORKS와 같은 3D 설계 소프트웨어를 사용하여 미세계통 레이아웃을 준비하고 설계를 CNC 밀링 머신으로 전송합니다. CNC 밀링 머신을 작동하여 채널과 챔버가 있는 디스크를 제작합니다. 이제 디스크와 나노섬유 매트를 통합할 준비가 되었습니다.진공 챔버, 실리콘 기판 및 플루오로실란을 준비합니다. 진공 상태에서 30분 동안 플루오로실란으로 실리콘 기판을 실란화합니다. 경화제와 프리폴리머를 10:1 비율로 준비하여 게스트 PDMS를 준비하고, 650RP

fully-automated-centrifugal-microfluidic-device-for-ultrasensitive

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

전기 분야의 응용 프로그램에 의해 전극의 배열에 - 디지털 Microfluidics는 개별 방울 (ML ~ NL)의 조작에 의해 특징 기법입니다. 그것은 빠른 속도, 순차, 소형 자동 생화학 assays을 수행에 적합합니다. 여기서 우리는 몇 가지 proteomic 처리 단계를 자동화 할 수있는 플랫폼을보고합니다.

자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

자동 microfluidic 장치는 세포 손실없이 고품질의 샘플의 절연을 보장 적혈구 용해를 통해 말초 혈액에서 nucleated 세포 농축을 순환하기 위해 개발되었습니다.

Nucleated 셀을 순환의 강화를위한 자동 Microfluidic 혈액 용해 프로토콜

이 비디오는 인간의 혈소판에서 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 관련된 단백질 바이오마커를 검출하기 위한 모세관 전기영동 면역분석 프로토콜을 보여줍니다. ALS 바이오마커 단백질의 존재 확인은 혈소판 단백질의 크기 기반 분리와 화학발광 검출을 통해 이루어집니다.

단백질 바이오마커 검출을 위한 모세관 전기영동 면역분석

이 비디오는 자기 나노 입자 기반 면역 분석을 위한 미세유체 시스템을 보여줍니다. 감지 시스템은 채널 내에 자기 트랩을 통합한 미세유체 장치를 사용합니다. 1차 항체와 과산화효소 접합 2차 항체에 결합된 항원 코팅된 자성 나노입자로 구성된 사전 형성된 면역복합체가 채널로 도입됩니다. 면역복합체는 외부 자기장을 가할 때 다공성 자기 트랩에 포획됩니다. 과산화효소(peroxidase)에 의한 촉매 작용 시 형광을 방출하는 형광성 기질을 사용하여 포획된 면역복합체를 현미경으로 검출합니다.

미세유체 소자를 이용한 자성 나노입자 기반 면역분석법

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

이 프로토콜은 강력한 재현성 전체 혈액 한 방울에서 인간 호중구의 화학 주성을 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 호중구의 분리의 필요성을 우회하고 분석 준비 시간의 몇 분을 필요로한다. 마이크로 유체 칩은 유아 또는 샘플의 양이 제한되어 작은 포유 동물에 시간이 지남에 따라 호중구의 화학 주성의 반복 측정을 가능하게합니다.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

이 프로토콜은 미세유체 소자를 사용하여 자동화된 소량(0.15–1.5ml) 입자 분리를 수행하기 위한 시스템 아키텍처를 설명하고 음향 유체 소자 성능 및 작동을 최적화하는 방법에 대해 설명합니다.

미세 유체 정밀 작은 볼륨 샘플 처리를위한 플랫폼 및 음향 마이크로 디바이스로 구분 생물 입자 크기의 사용

여기에서는 모세관 기반 원심 미세유체 장치를 사용하여 크기 제어 가능한 단분산 W/O(Water-in-Oil) 미세방울에 대한 간단한 생산 방법을 보여줍니다. 이 방법은 소량의 시료만 필요하며 고수율 생산이 가능합니다. 우리는 이 방법이 신속한 생화학 및 세포 분석에 유용할 것으로 기대합니다.

단 분산 미세 방울의 크기가 제어 형성을위한 모세관 기반 원심 미세 유체 장치

미세 바이오 센서 플랫폼 설계 및 다양 한 analytes의 신속 하 고 민감한 정량화에 대 한 낮은 비용 드라이 필름 포토 레지스트 기술을 사용 하 여 조작. 이 단일 사용 시스템 중지 흐름 기술에 의하여 효소 연결 된 분석 실험에-칩-움직일의 전기 판독을 허용합니다.

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

전기 습윤 기반 디지털 미세 유체는 마이크로 리터 볼륨 액적의 명백한 접촉 각도에서 전압 구동 변화를 활용하여 조작을 용이하게하는 기술입니다. 이를 기능화된 자기 비드와 결합하면 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 병원균의 시료 준비 및 식별을 위한 여러 실험실 단위 작업의 통합이 가능합니다.

자동화된 효소 연계 면역흡착제 분석기용 전기습식 기반 디지털 미세유체 분석 플랫폼

미세 유체 공학은 진단 테스트 개발을위한 강력한 도구입니다. 그러나 값비싼 장비와 재료, 힘든 제조 및 취급 기술이 필요한 경우가 많습니다. 여기에서는 저비용 및 사용이 간편한 환경에서 자성 마이크로 및 나노 입자 기반 면역 분석을위한 아크릴 미세 유체 장치의 제조 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

컴퓨터 수치 제어 자기 나노 입자 기반 면역 분석에 대한 엇갈린 제한이있는 미세 유체 아크릴 장치의 마이크로 밀링

배우세요 전혈에서 펨토몰 농도 단백질을 30분 내에 검출하는 완전 자동화 원심 미세유체 장치 기법을. 나노섬유 통합 디스크 플랫폼을 활용하여 고감도 진단 분석을 수행하는 방법입니다.

전혈에서 고감도 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치

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