Name: 胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ、胞胚の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の作製法。Danio rerioを用いて細胞自律性と非自律性を解析し、造血系などの遺伝子機能を研究する強力な手法を習得できます。

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原稿に対する有益なコメントをいただいたJulie R. Perlinに感謝します。D.I.S.は、米国血液学会、Cooley's Anemia Foundation、およびNIH（K01DK085217およびR03DK100672）からの助成金によってサポートされています。E.J.H.は、Helen Hay Whitney FoundationのHoward Hughes Medical Instituteフェローです。B.L.は、Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellowです。B.W.B.は、Cancer Research InstituteのIrvington FellowshipおよびYoung Investigatorによってサポートされています。ASCOのConquer Cancer Foundationから賞を授与されました。L.I.Z.は、NIH(R01CA103846、P01HL032262、R01HL04880)、Taub Foundation for MDS Research、Harvard Stem Cell Instituteからの助成金によって支援されており、Howard Hughes Medical Instituteの研究者です。

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</ol>

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

並体結合融合は、大人のマウスモデルおよびニワトリ胚10-14で候補遺伝子の細胞機能を調査するための強力なツールとなっています。より最近では、胞胚融合方法は、結合したゼブラフィッシュ胚15を生成するために記載されています。本プロトコルでは、ビデオベースのチュートリアルを示し、より良い造血開発に関心のある候補遺伝子の、一時的なセル固有の、および細胞外因性の役割を研究するために、異なる遺伝的背景の並体結合ゼブラフィッシュ胚を作成するための方法を説明するために使用されます以降。 この論文に記載された方法は、最近1胚、異なる遺伝的背景の胚への血液循環を介した移行、その後の生着および分化16におけるHSCの出現を追跡するために使用されました。喫茶グループの知見と一致して、ステージング及び胚の位置が成功率を決定することが見出されましたそして、並体結合融合の解剖学的な性質。プロトコルへのいくつかの重要な変更を加えるだけで、parabiontsは有意に高い生存率で生成されました。創傷後3秒間、その後必要に応じて、...

野生型および遺伝子改変動物の間の遺伝的モザイク（キメラ）の作成 ​​は、細胞固有の候補遺伝子1-6の細胞外部関数に対する調査するための十分に確立し、古典的な戦略です。ゼブラフィッシュにおける胞胚移植は広く、細胞自律7-9の研究のためのキメラ胚を生成するために利用されてきました。目的の組織に応じて、しかし、予想通り、所望の組織（ 例えば、血液）1-3、7-9にドナー細胞を標的化するために挑戦することができます。マウスの遺伝学者は、長い共有循環10-14と結合した生物を生成するために、並体結合外科的方法を利用してきました。並体結合動物が共通の血流を共有しているため、異なる遺伝的背景の他の動物の細胞と一匹の動物由来の細胞間の相互作用は、10-16を研究することができます。最近、カリマ喫茶のグループは、エレガントなCREする能力を示しました移行15（HSPC）結合したゼブラフィッシュ胚を食べ、その後、造血幹細胞および前駆細胞を研究するためにこのシステムを使用しています。また、ゼブラフィッシュ並体結合は最近、造血幹細胞（HSC）の出現と移行、16で内皮カドヘリン5の役割を調査し、ゼブラフィッシュの開発17時のHSPCのニッチで間質細胞の役割を研究するために使用されました。 マウスとは異なり、ゼブラフィッシュの胚は透明であり、システムがユニークでパワフルな作り、並体結合開発中の細胞の直接可視化を可能にします。ゼブラフィッシュにおける並体結合の有用性は、しかし、急な学習曲線によって制限され、かつ繊細な胚上の並体結合手術は、詳細な指示とビジュアルデモせず、技術的に挑戦することができます。このプロトコルの目的は、研究するための並体結合ゼブラフィッシュの胚を生成する方法についてのビデオベースのチュートリアルを伴うために明確な、ステップバイステップの命令のセットを提供することです時間的、細胞固有の、または胞胚を開発するの外科的融合による候補遺伝子（複数可）の細胞外部関数。増加parabiont生存と新しい実験的なアプリケーションのためのキーの変更や追加の推奨事項が含まれています。

<table><tbody><tr><td>メチルセルロース</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>E3/HCR用個別成分:</td><td></td><td>1L用:1L:14,61g NaCl、0,63g KCl、2,43g CaCl2-2H2O、1,99g MgSO4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl(塩化ナトリウム)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl(塩化カリウム)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2(塩化カルシウム二水和物)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4(マグネシウム硫酸塩七水和物)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes(1M)緩衝液</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー15630-080</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>gibco by Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin sodium salt</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml 針に使用される毛細血管ガラス11459643001 Streptomyces griseus Rocheからのプロナーゼ</td><td></td><td></td>(毛細管ガラス&<td></td></tr><tr><td>フィラメント)</td><td>Sutter</td><td>Instrument ITEM#:BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>木製ハンドル付きからかい針</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペットフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>10 mlピペットポンプ(緑)(ピペットポンプピペッター)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>直径 100 mm/深さ 20 mm プラスチック ペトリ皿 (PETRI DISH、100/20 MM、PS、透明、通気口付き、 ヘビー デザイン、15 個/袋)</td> <td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran、Cascade Blue、10,000 MW、アニオン性、リジン固定可能</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. 作業ストックは 0.003% (50x は 0.15%) 500 ml の場合、0.75 g N-Phenylthiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン(粉末)(トリカインメタンスルホント、トリカイン-S)</td><td>ウエスタンケミカル社</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMPアガロース(超高純度LMPアガロース)</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック転写ピペット(ちょうど幅の広いものだと思います)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>イメージングに使用されるガラス底6ウェルプレート</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>木製の柄の解剖針の端に固定されたプラスチックウエスタンゲルローディングチップ(GELoaderチップ)</td><td></td>直立顕微鏡用に取り付ける場合、<td>Eppendorf</td> 22351656<td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ、スライド、真空グリース:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空グリース(ダウコーニング&reg;高真空シリコーングリース 無色、重量5.3オンス(チューブ))</td><td>ダウコーニング</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>コーニングライフサイエンス</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の生成

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

異なる遺伝的背景の2匹の動物の外科並体結合は、異なる遺伝的設定で細胞固有の関心の候補遺伝子のための細胞外因性の役割、細胞の移動行動、および分泌シグナル対を研究するユニークなシナリオを作成します。並体結合動物が共通の循環を共有しているため、一匹の動物からの血液や血液媒介因子は、そのパートナーとその逆と交換されます。したがって、一つの遺伝的背景に由来する細胞および分子因子は、第二の遺伝的背景との関連で研究することができます。成体マウスの並体結合研究の老化、癌、糖尿病、肥満、および脳の発達に広く使用されています。さらに最近では、ゼブラフィッシュ胚の並体結合は、造血の発生生物学を研究するために使用されています。マウスとは対照的に、ゼブラフィッシュ胚の透明な性質は、それFを調査するためのユニークでパワフルな方法作り、並体結合文脈での細胞の直接可視化を可能にしますundamental細胞および分子メカニズム。この技術の有用性は、しかし、並体結合ゼブラフィッシュ胚を生成するための急な学習曲線によって制限されます。このプロトコルは、関心のある候補遺伝子の役割を調べるために、異なる遺伝的背景の2ゼブラフィッシュの胚の胞胚を融合外科的にする方法についてステップバイステップの方法を提供します。また、並体結合ゼブラフィッシュ胚を可能遺伝子発現の時間的制御を行う、熱ショックに対して耐性です。この方法は、高度なセットアップを必要とし、胚発生の間、in vivoでの細胞遊走、運命の仕様、および分化を研究するための幅広い用途を持っていません。

以前に発表された研究15と一致して、ゼブラフィッシュ胚の成功並体結合融合は、ステージングと向き2胚のとメチルセルロースの濃度に依存します。いくつかの簡単な、安価なツールを使用して、外科的に融合した開発胞胚は、共有循環と並体結合胚に成長し、その生成しました。これらのツールは、変更されたパスツールピペット、10ミリリットルのピペットポンプ、および単独で、またはラボ・フィルムによって端部に固定されたゲルローディングチップやガラスマイクロインジェクション針（ 図1）のいずれかで使用された木材取り扱いからかい針が含まれていました。 4％のメチルセルロース二つ胞胚を配置し、それらの動物極が互いに（ 図2A）に向けてそれらを配向するゲルローディングチップを使用した後、胚を、慎重にガラスマイクロインジェクションnでその接触点で負傷しましたeedle（ 図2B）。...

このプロトコルは、異なる遺伝的背景を持つパラビオティックゼブラフィッシュの胚を生成する方法についての段階的な指導を提供します。ゼブラフィッシュ胚の比類のないイメージング能力と組み合わせることで、この方法は、目的の候補遺伝子の細胞自律機能と非細胞自律機能を調べるための独自の強力な手段を提供します。

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

本手法の全体的な目的は、パラバイオティック（並列生存）ゼブラフィッシュ胚を作製し、目的とする候補遺伝子の細胞内在的機能と細胞外在的機能を研究することです。この方法は、細胞自律性に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。例えば、造血系において、HSC（造血幹細胞）の遊走における致命的な欠陥が、HSC自体に起因するものか、あるいはニッチ微小環境に起因するものかを判別することが可能です。このプロトコルの主な利点は、パラバイオシスゼブラフィッシュ胚の作製成功率が向上することです。一般的に、この手法に不慣れな方は、発生中の胚が非常に脆弱で損傷しやすいため、習得に苦労することがあります。外科的な縫合ステップは高度な正確性と精密さが要求されるため、習得が困難な場合があり、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。ここでは、発達中の胞胚を外科的に融合させることにより、パラバイオティック・ゼブラフィッシュ胚を作製するための詳細な手順を説明します。この手法は、パラバイオティック融合の効率を高め、結合胚の生存率を向上させる方法を示すものです。テキストプロトコルに従って試薬と器具を準備した後、ブンゼンバーナーでピペットの先端を軽く加熱し、改造したパストゥールピペットを2～3本用意します。次に、大きな鉗子を用いて、ピペットがまだ熱いうちに先端を約45度に曲げます。胚を傷つける可能性のある鋭いエッジがないことを確認するため、ピペットの先端をブンゼンバーナーの上で1〜2秒間加熱します。プラズマDNA、mRNA、またはモルフォリノを用いて、採取後1時間以内に胚に微量注入を行い、256細胞期まで発育させます。胚が256細胞期に近づいたら、各遺伝的背景の胚を、個別のアガロースコート済みディッシュ、傷のないガラスビーカー、またはペトリ皿に転写します。テキストのプロトコルに従って胚の脱膜を行った後、あらかじめ調製しておいたメチルセルロースを融解させ、卓上遠心機を最大速度で回転させて未溶解の結晶をペレット化します。これらの結晶は胚を損傷させたり、卵黄を破裂させたりする可能性があります。その間に、マーカーを用いて、100 mLのアガロースコート済みペトリ皿の底面に、あらかじめ定めた12〜15箇所のスポットを印付けします。その後、遠心分離を行い、メチルセルロースの上清を用いて、1.5 centimeterのドロップをペトリ皿の印をつけたスポットに1滴ずつ移します。次に、準備したアガロースコート皿1枚につき、40 milliliterの高カルシウムリンガー（HCR溶液）を1アリコート分用意します。それぞれのアリコートに、ここに記載された抗生物質を添加します。胞胚融合を行う準備ができたら、抗生物質含有HCRの分注液を用いて、メチルセルロース液滴が入った各ディッシュに注意深く満たします。この際、液滴を壊さないようにしてください。事前に準備した改良ガラスパステールピペットを10ミリリットルのピペットポンプに取り付けます。次に、実体顕微鏡下で、各バックグラウンドから脱卵膜処理済みの胚を1個ずつ回収します。2つの胚を分注する前に、パスツールピペットを使用して、メチルセルロース液滴の中央に小さなくぼみを作ります。次に、そのくぼみに2つの胚を配置します。続いて、先端にゲルローディングチップを装着したティージングニードルを用い、胚に直接触れないようにして緩やかに掃引するように動かし、胚の動物極同士が直接接するように、メチルセルロース内で慎重に位置を調整します。発生中の胚を適切に向き合わせることで、胚の融合および発達の仕方が決まります。頭対頭の融合を行う場合は、各融合部位が動物極で揃っていることを確認してください。メチルセルロースが胚の周囲に落ち着くまで、5分間静置します。この間に、次のペアを別の液滴にロードします。手術を行うには、ガラス針ツールを使用して、各胚の接触点を慎重に傷つけます。その後、優しく縫い合わせるような動作で、1つ目の胚から2つ目の胚へ、そして再び戻るように細胞を引き寄せます。動作の終わりに、針を2～3秒間そのまま保持し、その後非常にゆっくりと引き抜きます。胚が適切に縫い合わされるようにするためには、ガラス針による精密な操作が極めて重要です。融合を成功させるために十分な接続を維持しつつ、卵黄嚢を傷つけないよう注意してください。胚を室温で10～15分間静置します。その間に、追加の胚のペアを縫合します。インキュベーション後、胚が付着したままであるかを確認し、必要に応じて傷害処置のステップを繰り返します。胚を同じディッシュと培地に入れ、28.5 °Cで一晩インキュベートします。翌朝までには、胚はほぼ溶解したメチルセルロースから脱出しています。正常に融合しなかった胚は取り除いてください。次に、培地をデカンテーションで除き、25 millilitersのE3で置換します。融合胚の画像を取得するために、0.8%低融点アガロースを調製します。アガロースが熱いうちに、37 degree Celsiusのヒーティングブロックにセットした1.5 milliliterマイクロチューブに、アガロースを1 milliliterずつ分注します。胚が含まれている25 mLのE3培地に、4 mg/mL pH 7.0のトリカインを1 mL加えて、パラバイオティック胚を麻酔します。ディッシュを静かに回し、胚を中央に集めます。次に、先端の広いプラスチック製転送ピペットを使用して、液体をできるだけ少なくして胚を吸い上げます。次に、ピペットを垂直に立て、胚を軽く弾ませてピペットの最底部に集めます。その後、ピペットの先端を低融点アガロースの表面に軽く触れさせ、胚を1 mLのアガロース分注液に移します。ピペット内の余分な液体は廃棄し、ピペットを用いて胚をアガロース中で穏やかに混合します。次に、ピペットを用いて、アガロースと胚をガラスボトム6ウェルプレートのウェルに移します。実体顕微鏡下で、解剖針の先端に取り付けたゲルロードチップを使用し、胚をカバーガラスの近くに、かつイメージングに最適な方向で配置します。アガロースが固まり、トリカインを含む培地をウェルに添加した後、倒立広視野エピ蛍光レーザー走査型共焦点顕微鏡または回転円盤共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影します。胚全体の視野を得るには、4X対物レンズを使用してください。特定の組織を撮影する場合は、20X対物レンズを使用してください。画像処理はテキストプロトコルに従って行ってください。ここに示されているように、2つの胚盤胞の動物極を互いに向かい合わせに配置した後、接点において胚を慎重に傷つけました。傷つける程度を大きくすることで、胚同士の接続が維持される可能性が高まり、追加の形態学的欠陥や発生の遅延を伴わずに融合を成功させることができました。この図で示されている通り、2つの胚盤胞の動物極を直線的に揃えて配置することで、血流を共有した信頼性の高い頭部同士、または卵黄嚢同士の融合を生成できました。ほとんどの場合、胚は2つの心臓を持ち、共通の循環系を共有していました。胚が実際に循環を共有していることを確認するため、GFP陽性赤血球を持つトランスジェニック胚を、mCherry陽性血管内皮細胞を持つ胚と融合させました。この動画に見られるように、受精から48時間後までに、GFP陽性赤血球がパートナーであるFlik 1 HRAS mCherry胚内を循環していることが観察されました。最後に、遺伝子発現の時間的制御を調べるため、2つの胚のうちの1つにhsp70 EGFP DNAコンストラクトを注入しました。37 °Cで30分間の短いヒートショックを与えた後、一方の胚で明確なGFPシグナルが確認され、場合によっては、注入していない相方の胚にGFP陽性細胞が循環しているのが見られました。この手法を習得し、適切に実施すれば、5時間で完了させることができます。この手順を行う際は、2つの胞胚を縫い合わせる際に注意すること、および、一度の手術で成功しなかった場合は融合をやり直すことが重要です。本手順に続き、ライブセルイメージングなどの追加手法を用いることで、野生型のHSCが変異ニッチで正常に機能できるか、あるいは逆に変異HSCが野生型ニッチで機能できるかといった、さらなる疑問を解決することができます。この手法は、血液学分野の研究者がゼブラフィッシュにおける血液発達の調節を研究するための強力な手段となります。トリカインは危険を伴う可能性があるため、本手順を実施する際は、適切な安全保護具の着用などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。このビデオを視聴し、推奨される手法に従うことで、より優れたゼブラフィッシュ胚をより高い成功率で作成できるようになることを願っております。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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ゼブラフィッシュ細胞移植は、組織特異的キメラを生成するために遺伝学と発生学の組み合わせを可能にします。このビデオでは、原腸胚の研究室では前脳の交連形成時のアストログリア集団と特定の指導の手がかりの役割を調査することを許可している細胞移植を段階を示しています。...

組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

我々は、胚発生時のライブイメージング細胞挙動のためのキメラゼブラフィッシュの胚を生成するプロトコルを示しています。...

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

このビデオでは、低融点アガロースを使用して生きたゼブラフィッシュの胚を6ウェルプレートにマウントする手順を順を追って説明しています。また、生きた胚の画像を取得し、ソフトウェアを使用して分析するプロセスも提供します。...

寒天マウント:長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚のマウントの基本的な方法

ゼブラフィッシュは、高等脊椎動物との遺伝的類似性から、発生生物学およびヒト疾患研究のための強力なモデルシステムです。このプロトコルは、初期胚形成に不可欠な遺伝子の劣性突然変異を特定するためのフォワードスクリーニング戦略に利用できる一倍体ゼブラフィッシュ胚を作成する方法論を説明しています。...

半数ゼブラフィッシュ胚の生成により<em&gt;体外</em&gt;受精

ゼブラフィッシュは、遺伝学および発生研究のための優れたモデルシステムです。ビーズ移植は、局所的な細胞環境の変化を導入することにより、発生メカニズムを調査するために使用できる貴重な組織操作技術です。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚にマイクロビーズ移植を行う方法について説明します。...

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

細胞の駆出や移植などの発生学的操作は、早期の発達を研究するための重要なツールです。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚でこれらの操作を行う簡単で効果的な移植装置を記述する。...

ゼブラフィッシュ胚の簡易かつ効果的な移植装置

ゼブラフィッシュ・ブラソドルム外植は、初期胚内の内在性シグナル伝達センターから胚細胞を単離することによって生成され、比較的ナイーブな細胞クラスターを容易に操作し、 培養したex...

ゼブラフィッシュ胚からのナイーブ・ブラストデム・エクスプラントの生成

この研究では、トランスジェニックコンストラクトを作成してゼブラフィッシュ胚に注入するためのゲートウェイベースのクローニング方法であるモジュラーTol2トランスジェネシスシステムのプロトコルについて説明します。...

ゼブラフィッシュTol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ

ここでは、受精後少なくとも1〜7日の任意の段階で、ゼブラフィッシュの胚と幼虫に高い空間的および時間的解像度で細胞を移植するためのプロトコルを紹介します。...

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

学ぶ、胞胚の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の作製法。Danio rerioを用いて細胞自律性と非自律性を解析し、造血系などの遺伝子機能を研究する強力な手法を習得できます。

胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の生成

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