Ein detailliertes Protokoll der murinen C1498-Zelllinie und der damit verbundenen Leukämie Maus-Modell für Charakterisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, murine C1498-Zellen und die akute Leukämie zu charakterisieren, die sie nach intravenöser Injektion in Mäuse auslösen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass die murine myelomonozytäre Leukämie, die nach einer Injektion von C1498-Zellen auftritt, zahlreiche Merkmale der menschlichen Erkrankung aufweist. Dieses Tiermodell kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hämatologie zu beantworten, beispielsweise, welche Mechanismen zur Entstehung von Leukämie und Immundefizienz führen.

Die Bedeutung dieses Tiermodells erstreckt sich auf die Behandlung von Leukämie, da es die Prüfung neuer chemotherapeutischer und immuntherapeutischer Wirkstoffe ermöglicht. Überführen Sie zunächst eine fünf bis sechs Wochen alte weibliche kongene C57 black 6 Maus in eine sterile Flusskammer. Danach platzieren Sie das Tier in einer Fixiervorrichtung.

Laden Sie als Nächstes eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 29-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit 100 Mikrolitern Zellen auf. Greifen Sie an das Schwanzende und desinfizieren Sie die Schwanzhaut mit einem mit 70 % Ethanol getränkten Mulltuch. Injizieren Sie dann langsam eine mal zehn hoch sechs Zellen in eine seitliche Schwanzvene.

Wenn alle Zellen verabreicht wurden, entfernen Sie die Nadel und üben Sie mit steriler Gaze sanften Druck an der Injektionsstelle aus. Danach bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und überwachen es in den folgenden Wochen sorgfältig. 17 bis 19 Tage später führen Sie ein Kapillarrohr in den medialen Augenwinkel des anästhesierten leukämischen Tieres ein.

Es werden 100 bis 200 Mikroliter Blut aus dem Orbitalsinus in das Kapillarrohr entnommen. Entfernen Sie das Rohr und stillen Sie die Blutung durch vorsichtige Anwendung eines sterilen Gazetupfers auf das Auge. Anschließend wird das Blut in ein EDTA-Röhrchen überführt und bis zur Isolierung der mononukleären Zellen auf Eis aufbewahrt.

Um die mononukleären Blutzellen zu isolieren, zunächst PBS mit einem Millimolar EDTA bis zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern hinzufügen. Danach die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Als Nächstes 500 Mikroliter Trennlösung mit einer 1-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist, vorsichtig unter das Blut schichten, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Schichten nicht vermischt werden.

Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie eine Pipette, um die opak-weiße mononukleäre Zellschicht in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Waschen Sie die Immunzellen anschließend in einem Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie sie erneut und resuspendieren Sie das Pellet in 600 Mikrolitern FACS-Puffer zur Färbung und Analyse per Durchflusszytometrie.

Um das Knochenmark zu isolieren, legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Plastikbrett und sichern Sie die Gliedmaßen des Tieres. Desinfizieren Sie das Tier mit 70 % Ethanol. Schneiden Sie dann jedes Bein am oberen Ende des Femurs oberhalb des Gelenks ab und ziehen Sie vorsichtig an den Tibiae, um sie von den Femura zu lösen.

Entfernen Sie mit Pinzette und Schere die Haut und die Muskulatur von den Knochen und überführen Sie die Knochen in eine Petrischale auf Eis. Entfernen Sie mit der Schere die Extremitäten. Stechen Sie dann jeweils an einem Knochenende eine Nadel mit 26 Gauge, die an eine 10-Milliliter-Spritze mit fünf Milliliter kalter PBS angeschlossen ist, ein und spülen Sie das Knochenmark in die Schale.

Führen Sie die Zellsuspension mehrmals durch die Nadelöffnung, um die Knochenmarkzellen aufzulösen. Anschließend filtrieren Sie die Zellen durch einen neuen 70-Mikron-Filter in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter Lysepuffer.

Füllen Sie das Röhrchen sofort mit bis zu 50 Milliliter kaltem PBS und zentrifugieren Sie die Zellen. Suspendieren Sie das Knochenmarkspellet anschließend bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in kaltem FACS-Puffer. Um die Knochenmarkzellen für die Färbung vorzubereiten, stellen Sie zunächst Objektträger in Einwegkammern mit vormontierten Filterkarten und setzen Sie die Kammern in eine Zytospinzentrifuge.

Fügen Sie 100 Mikroliter FACS-Puffer zu jeder Filterkartenkammer hinzu und zentrifugieren Sie die Objektträger kurz. Geben Sie am Ende des Zentrifugierens 100 Mikroliter Zellen zu jeder Kammer hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen. Entfernen Sie anschließend die Objektträger vorsichtig aus den Kammern, um sie an der Luft trocknen zu lassen.

Um die Knochenmarkzellen zu färben, tauchen Sie die Objektträger für fünf Minuten in ein Coplin-Glas mit May-Grünwald-Lösung ein. Danach überführen Sie die Objektträger für eine Minute in ein Gefäß mit Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8. Anschließend überführen Sie die Objektträger für 10 Minuten in Giemsa-R-Lösung.

Anschließend eine 10-sekündige Wäsche mit pH-neutralem Wasser durchführen. Nach der Wäsche die Objektträger lufttrocknen lassen und je eine Tropfen Eindeckmedium auf jede Probe geben. Danach eine Kante eines Deckglases auf den Objektträger setzen und das Deckglas vorsichtig auf die Zellen absenken, wobei leicht gedrückt wird, um Luftblasen zu entfernen.

Im Vergleich zu Kontrolltieren zeigen die mit C1498-Zellen injizierten Tiere eine massive Infiltration von C1498-Zellen im Knochenmark, wie durch das blastenähnliche Erscheinungsbild der Zellen beobachtet werden kann. Die das Knochenmark infiltrierenden C1498-Zellen weisen monozytäre und granulozytäre Phänotypen auf, die jeweils für monozytäre Blasten und myelozytäre Blasten charakteristisch sind und für eine akute myelomonozytäre Leukämie typisch sind. Die Durchflusszytometrie-Analyse der mononukleären Zellhäufigkeiten in Blutproben der mit C1498 injizierten Mäuse zeigt, dass etwa ein Viertel der gesamten Leukozytenpopulation aus leukämischen Zellen besteht.

Die Häufigkeiten von T- und B-Lymphozyten sind zwischen Kontroll- und C1498-injizierten Tieren vergleichbar. Die Monocytenhäufigkeiten hingegen sind bei C1498-injizierten Mäusen erhöht, ein Merkmal der akuten myelomonocyten Leukämie. Bei der Durchführung der Zytchemie- und May-Grünwald-Giemsa-Verfahren ist es wichtig, die geeigneten pH-Werte, Temperaturen und Inkubationszeiten einzuhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie akute myelomonozytäre Leukämie charakterisiert werden kann. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Hämatologie den Weg, um die Natur spontaner und induzierter akuter Leukämien in anderen Tiermodellen zu erforschen.