Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre trofoblásticas inducidas de buena fe o iTSC a partir de fibroblastos murinos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre con respecto a la naturaleza de la barrera que separa el linaje embrionario del extraembrionario. La principal ventaja de esta técnica es que la expresión transgénica solo se activa de forma transitoria, lo que facilita la selección de células convertidas de forma estable.

En un laboratorio de nivel de bioseguridad dos con el equipo de protección personal adecuado, cubra cinco platos de 100 mililitros con cinco mililitros de solución de poli-L-lisina, balanceando suavemente las placas para distribuir uniformemente la solución de recubrimiento. Coloque los platos en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos, luego aspire la poli-L-lisina y enjuague los platos una vez con PBS. A continuación, coloque siete veces 10 a 6 células T 293 por placa en 10 mililitros de medio de células T 293, agite las placas para distribuirlas uniformemente y devuelva las placas a la incubadora.

A la mañana siguiente, reemplace el medio de crecimiento con cinco mililitros de medio de transfección. A continuación, trate los cultivos con seis microlitros de una solución de cloroquina 1000X y vuelva a colocar las placas en la incubadora a 37 grados centígrados. Para preparar la mezcla de transfección, para cada vector lentiviral, agregue 600 microlitros de solución de ADN Lentivector gota a gota en 600 microlitros de solución salina tamponada 2X HEPES mientras se agita el vórtice e incube la mezcla de transfección a temperatura ambiente.

Después de 15 minutos, agregue con mucho cuidado la mezcla gota a gota a las 293 células T preparadas y devuelva los platos a la incubadora. Después de cinco o seis horas, reemplace el medio con 10 mililitros de medio de producción del virus y vuelva a colocar las placas en la incubadora. A la mañana siguiente, reemplace cuidadosamente el medio con siete mililitros de medio de producción de virus fresco para otra incubación durante la noche.

A continuación, transfiera el medio de cada placa a tubos cónicos individuales de 15 mililitros y agregue siete mililitros de medio de producción de virus fresco a las placas para otra incubación durante la noche. A la mañana siguiente, coseche el segundo lote de medio que contenga virus, agrupando el sobrenadante con el primer lote de virus y cuele el medio que contiene virus a través de un filtro de membrana de acetato de celulosa sin surfactante de 0,45 micras para almacenarlo en alícuotas de 500 microlitros a menos 80. Para convertir los fibroblastos en células madre trofoblásticas inducidas, lave los fibroblastos embrionarios de masa transducida o MEF dos veces con dos mililitros de PBS.

A continuación, separe las células con 0,5 mililitros de solución de tripsina EDTA a 37 grados centígrados. Después de tres o cuatro minutos, confirme que las células se han levantado de la placa bajo un microscopio invertido y luego active la tripsina con un mililitro de medio TS. Transfiera las suspensiones celulares a tubos cónicos individuales de 15 mililitros y centrifugue las celdas.

A continuación, vuelva a suspender los gránulos en dos mililitros de medio TS y coloque dos veces 10 al quinto mCherry de cuatro factores o controle los MEF no transducidos por plato de 100 mililitros en 10 mililitros de medio TS que contenga factor de crecimiento de fibroblastos cuatro y heparina suplementada con doxiciclina para el cultivo nocturno. Al día siguiente, bajo un microscopio de epifluorescencia, utilice la expresión de la proteína mCherry para estimar la eficiencia de la transducción. Si la eficiencia de la transducción es de aproximadamente el 100%, devuelva los cultivos a la incubadora, cambiando el medio en todos los platos cada dos días hasta el día 10.

A partir de entonces, alimente las células con medio TS fresco que contenga el factor de crecimiento de fibroblastos cuatro y heparina sin doxiciclina utilizando el microscopio invertido para controlar la aparición de áreas transdiferenciadas en la placa de cuatro factores durante un máximo de tres semanas. La identificación de las áreas transdiferenciadas es crítica, ya que en este punto, las MEFs no se parecen morfológicamente a las células madre trofoblásticas. Busque colonias densamente apiladas adyacentes a las células gigantes del trofoblasto que se identifican por su tamaño celular y su gran núcleo.

Para aislar líneas individuales de iTSC, primero limpie el microscopio invertido con etanol al 70% para minimizar la posibilidad de contaminación bacteriana. A continuación, agregue 40 microlitros de 05% de tripsina EDTA en 12 pocillos de una placa de pocillo inferior de 96 U y coloque la placa en hielo. Ahora aspire el medio de la placa de transdiferenciación MEF de cuatro factores y lave las celdas una vez con 10 mililitros de PBS.

Después del lavado, agregue 10 mililitros de PBS fresco a las células y coloque la placa en la platina del microscopio invertido. Con una pipeta de 100 microlitros ajustada a 40 microlitros, rodee cada colonia individual con la punta de la pipeta y aspire la colonia flotante resultante. Transfiera cada colonia a pozos individuales de la placa de 96 pocillos hasta que se hayan seleccionado 12 colonias.

Luego incubar las colonias a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Al final de la incubación, disocie las células con pipeteo y transfiera las suspensiones celulares a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos que contenga 500 microlitros de TS completo más factor de crecimiento de fibroblastos y medio de heparina para el cultivo nocturno. Al día siguiente, reemplace el medio con TS completo fresco más factor de crecimiento de fibroblastos y medio de heparina para eliminar las células muertas y devolver la placa a la incubadora.

Seguimiento diario de los cultivos para la aparición de colonias epiteliales con límites brillantes. Cuando se observan las colonias, se cultivan las células durante un máximo de una semana o hasta que tengan un 70% de confluente. En cultivos donde se activa la expresión transgénica de los cuatro factores, las células cambian rápidamente de morfología.

Alrededor de los días 14 a 21, emergen distintas áreas transdiferenciadas. Estas colonias primarias carecen de la morfología típica de las células madre del trofoblasto, sin embargo, una vez que se subcultivan, se observa una morfología epitelial característica con bordes apretados y límites brillantes, que recuerda mucho a las células madre del trofoblasto de buena fe. Cuando las células madre del trofoblasto inducido por los cuatro factores permanecen positivas para el factor de transcripción del trofoblasto, Cdx2 y Tfap2c, la idea de estas líneas se puede utilizar para análisis posteriores In Vitro o InVivo.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis semanas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inyección asistida por chorreado, para responder preguntas adicionales sobre el potencial de quimerización de los iTSC generados. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la segregación temprana del linaje exploraran la conversión del destino de las células embrionarias frente a las extraembrionarias en ratones.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo convertir directamente nuevos fibroblastos embrionarios en células madre de trofoblastos inducidos. No olvide que trabajar con vectores lentivirales puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben seguir precauciones como el uso de procedimientos de trabajo apropiados de nivel de bioseguridad dos.