배양 된 세포를 세포 열 효과를 조사하기 위해 가열하는 연속파 툴륨 레이저

이 절차의 전반적인 목표는 배양된 세포를 정밀한 온도 및 시간 제어로 가열하여 체외에서 열 선량에 따른 세포의 생물학적 반응을 연구하는 것입니다. 이 방법은 망막 레이저 치료 연구와 같이 온열요법에 대한 세포 또는 조직의 반응을 조사하는 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포의 빠른 가열과 가열 지속 시간을 정밀하게 제어하여 실험 중에 높은 재현성 있는 열 노출을 허용한다는 것입니다.

이 방법은 열 레이저 조사에 대한 배양된 망막 색소 상피 세포의 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암세포와 같은 다른 모델에도 적용할 수 있습니다. 우리는 가시광선 레이저 광으로 멜라닌 함유 세포를 가열할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 그러나 이로 인해 색소 침착의 변화로 인해 온도 프로파일이 다양해졌습니다.

절차를 시작하려면 깨끗한 벤치의 조정 가능한 금속 실험실 스탠드에 핫 플레이트를 놓습니다. 핫플레이트를 섭씨 39도로 설정합니다. 코어 직경이 0.22마이크로미터인 365NA 광섬유를 스탠드의 수평 암에 고정합니다.

금속 암을 핫 플레이트 위에 놓고 파이버 팁이 핫 플레이트에서 12cm 위에 있도록 스탠드를 조정합니다. 1.94마이크로미터 20와트 툴륨 레이저를 365나노미터 1밀리와트 조준 빔과 파이버 팁에 연결합니다. 핫 플레이트에 직경 30mm의 배양 접시를 놓습니다.

핫 플레이트 표면에서 접시의 둘레를 조심스럽게 추적한 다음 접시를 제거합니다. 조준 빔을 켜고 핫 플레이트의 빔 스폿 중심이 추적된 원과 일치할 때까지 스탠드를 조정합니다. 그런 다음 조준 빔을 끕니다.

온도 보정 절차를 시작하려면 분젠 버너로 20게이지 바늘 끝을 가열합니다. 가열된 바늘 끝으로 직경 30mm의 배양 접시를 90도 간격으로 4개 지점에서 바닥에 가깝게 뚫어 직경 약 300마이크로미터의 구멍을 만듭니다. 구멍 위에 전기 테이프를 붙입니다.

가는 바늘을 사용하여 각 구멍을 덮고 있는 테이프에 약 200마이크로미터 직경의 구멍을 뚫습니다. 배양 접시의 아래쪽에 180도 떨어진 각 구멍 쌍 사이에 선을 그립니다. 선의 교차점에서 시작하여 각 선을 따라 반경 방향으로 3mm마다 표시하여 21개의 측정 지점을 지정합니다.

그런 다음 섭씨 1.2도로 예열된 정확히 37ml의 신선한 배양 배지를 접시에 넣습니다. 접시를 덮고 핫 플레이트의 추적된 원으로 접시를 놓습니다. 직경 200마이크로미터의 열전대를 레이저 제어 컴퓨터에 연결하고 온도 교정 프로토콜을 엽니다.

열전대를 접시의 구멍 중 하나에 삽입하여 팁이 표시 위치 중 하나의 접시 바닥에 오도록 합니다. 온도는 깊이에 따라 달라질 수 있으므로 열전대의 끝이 측정된 정밀도로 접시 바닥에 닿는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 배양 배지가 섭씨 37도에서 안정화될 때까지 기다립니다.

그런 다음 툴륨 레이저를 켜고 레이저 출력을 원하는 시작 수준으로 설정합니다. 예열 시간이 140초와 8초로 설정되어 있는지 확인한 다음 예열 조사 시퀀스를 시작합니다. 140초 후 신호음이 들리면 즉시 배양 접시의 덮개를 제거합니다.

예열이 끝나고 10초 조사가 진행될 때까지 기다립니다. 그런 다음 즉시 접시를 덮으십시오. 이런 식으로 21개 표시 위치에서 온도를 측정합니다.

이 절차는 레이저 출력 범위에 걸쳐 3와트 전력 간격으로 각각 세 번 수행합니다. 완료되면 툴륨 레이저를 끕니다. 온도 데이터를 내보내고 분석합니다.

실험에 앞서, 30 직경의 배양 접시에서 배양 렌탈 색소 상피 세포를 배양했습니다. 세포 배양을 5% 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도로 유지하고 살아있는 세포 이미징 시스템을 사용하여 확인합니다. 방사선 조사 1시간 전에 각 접시의 배양 배지를 정확히 1.2ml의 신선한 배양 배지로 교체하십시오.

배양물을 인큐베이터로 반환합니다. 조사 스테이션이 준비되었고 핫 플레이트가 섭씨 39도로 설정되어 있는지 확인합니다. 방사선 조사를 시작할 준비가 되면 원하는 출력으로 툴륨 레이저를 시작합니다.

실험 프로토콜을 열고 예열 시간이 140초와 8초로 설정되어 있는지 확인합니다. RPE 세포 배양액을 열판의 표시된 위치에 있는 밀폐된 접시에 놓고 즉시 140초 및 8초 예열 조사 시퀀스를 시작합니다. 140초 예열 후 접시 덮개를 제거하십시오.

예열이 끝나고 10초 조사가 진행될 때까지 기다립니다. 즉시 접시를 덮고 7초 동안 기다린 다음 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 증가하는 레이저 출력 레벨에서 추가 샘플을 조사합니다.

완료되면 툴륨 레이저를 끕니다. 세포 생존율 평가를 시작하려면 방사선 조사된 세포를 PBS로 세척합니다. 살아있는 세포사멸세포와 괴사세포를 구별할 수 있는 키트를 구합니다.

그런 다음 저조도에서 500 마이크로 리터의 결합 완충액을 25 마이크로 리터의 ethidium homodimer-3, FITC annexin 및 Hoechst 33342와 결합하십시오. 이 염색 용액의 세포를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 1X 결합 버퍼로 셀을 두 번 세척합니다.

결합 완충액을 PBS로 교체하고 DAPI, FITC 및 TRITC 필터가 있는 형광 현미경의 스테이지에 세포를 놓습니다. 현미경 광 경로를 접안 렌즈로 설정하고 DAPI 필터를 선택합니다. 조명 조명을 켜고 4X 대물 렌즈로 초점 평면을 찾습니다.

현미경 카메라에 대한 광 경로를 설정합니다. 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지의 중심을 잡고 초점을 맞춥니다. DAPI 필터를 사용하여 이미지 획득을 위한 매개변수를 정의합니다.

FITC 및 TRITC 필터를 사용하여 초점 프로세스와 이미지 획득 설정을 반복합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어를 사용하여 접시 전체에 걸쳐 3개의 필터 세트가 있는 여러 이미지를 획득하고 이를 전체 배양 접시의 단일 이미지로 결합합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여 세포사멸 및 세포 사멸에 대한 온도 임계값을 측정합니다.

세포 배양 접시 중앙에서의 최대 온도 증가와 레이저 출력 사이의 비례 관계는 설명된 열 보정 절차에 의해 결정되었습니다. 그런 다음 세포 배양 접시를 가로지르는 최대 온도 분포를 가우스 함수에 맞췄습니다. 방사선 조사 후 세 가지 염색 패턴이 관찰되었습니다.

섭씨 43도 이하의 온도에 노출된 배양에서는 생존 능력 변화가 관찰되지 않았습니다. 세포사멸은 섭씨 47도에서 방사선 조사 3시간 후에 처음 관찰되었습니다. 세포 사멸은 섭씨 51도 이상 후 3시간 이후에 관찰되었습니다.

그런 다음 세포사멸 및 세포 사멸에 대한 평균 임계값 온도는 측정된 사멸 및 세포사멸 영역의 반경 평균을 온도 분포를 설명하는 가우스 함수에 적용하여 결정되었습니다. 이 절차에 따라 다양한 레이저 프로파일, 스폿 크기 및 조사 시간과 같은 다양한 조건에서 방사선 조사를 수행할 수 있습니다. 이는 세포 수준에서 개별 시간 지정 온도 원인과 관련된 질문을 이해하고 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 온도와 시간을 잘 제어하여 세포 배양을 가열하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이는 다양한 열 조사 조건에 대한 생물학적 반응을 연구할 수 있는 가능성에 달려 있을 수 있습니다. 레이저로 작업하는 것은 눈과 피부에 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

레이저 조사 안전 교육에 대한 정보를 확인하십시오. 이 절차를 수행할 때는 항상 적절한 보안경, 실험복 및 장갑을 착용하십시오.