Name: Die Herstellung von Inverted Kolloid-Kristallen Poly (Ethylenglycol) Scaffold: Eine dreidimensionale Zellkultur-Plattform für Leber-Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von PEG-basierten inversen kolloidalen Kristallscaffolds für Lebergewebe-Engineering. Diese Methode ermöglicht längere Aufrechterhaltung der Hepatozytenfunktion und verbessert Anwendungen in der Arzneimittelprüfung.

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Die Autoren möchten Unterstützung von einer National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) und Competitive Research Programme (NRF-CRP10-2012-07) anzuerkennen.

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Tissue Engineering Gerüste entwickeln sich schnell notwendig , alle physikalischen und biochemischen Signale zu schaffen , sich zu regenerieren, zu warten oder zu reparieren Gewebe für die Anwendung von Organersatz, Krankheiten zu studieren, die Entwicklung von Medikamenten, und viele andere 57. In der Leber Tissue Engineering, verlieren primäre humane Hepatozyten schnell ihre metabolischen Funktionen einmal aus dem Körper isoliert, einen großen Bedarf an Engineering-Gerüste Schaffung und Entwicklung von Plat...

Die Leber ist ein stark vaskularisierten Organ mit einer Vielzahl von Funktionen, einschließlich der Entgiftung des Blutes, Metabolismus von Xenobiotika und der Produktion von Serumproteinen. Lebergewebe hat eine komplexe dreidimensionale (3D) Mikrostruktur, bestehend aus mehreren Zelltypen, Gallenkanälchen, Sinusoiden und Zonen unterschiedlicher Biomatrix Zusammensetzung und verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen. In Anbetracht dieser aufwendigen Struktur, ist es schwierig gewesen 1 eine richtige Lebermodell in vitro zu erzeugen. Allerdings gibt es eine steigende Nachfrage nach funktionellen in vitro - Modelle humanen Hepatozyten als Plattformen für die Prüfung Medikamententoxizität 2 - Hosting und Erkrankungen der Leber 3 zu studieren. Stromlebergewebe - Engineering - Plattformen haben die Komplexität der Leber vereinfacht eine durch Isolieren oder auf ein paar Fokussieren der Parameter des Leber, nämlich Co-Kultur von Zellen 4, biochemische Zusammensetzung der zonal Mikroumgebungen 5, Strömungsdynamik 6,7 und die Konfiguration der Biomatrix 8. Konfiguration der Biomatrix kann in Parametern wie Gerüstmaterial gebrochen werden, die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (ECM) Proteine, matrix Steifigkeit sowie das Design und die Struktur des Gerüsts. Es hat sich zu einem Anstieg der Tissue - Engineering - Studien synthetische Hydrogele unter Verwendung, insbesondere Poly (ethylenglycol) (PEG) Hydrogele 9, da die Fähigkeit zur Abstimmung der mechanischen Eigenschaften des Hydrogels, Bioaktivität und Abbaugeschwindigkeit. In Bezug auf Leberbezogene Forschung wurde das biokompatible Hydrogel für Virusinfektion Studie der Lebererkrankung 3 angewendet. Als Hepatozyten - Plattform - Design haben zahlreiche Studien Hepatozyten Sandwichkulturen 10,11 und Zellverkapselung innerhalb eines 12,13 Hydrogels verwendet , um die 3D - Umgebung und Zell-ECM und Zell-Zell - Wechselwirkung , die in vivo - Mikroumgebung nachzuahmen wesentlich sind bereitzustellen. However sind diese Plattformen nicht ein hohes Maß an Kontrolle und räumliche Organisation besitzen, was zu einer ungleichmäßigen Eigenschaften durch das Gerüst 14. Das invertierte Kristall kolloidalen (ICC) 14 Gerüst ist eine hochorganisierte 3D - Gerüst für die Zellkultur , die zuerst in den frühen 2000er Jahren eingeführt wurde. unter Verwendung eines Kolloid-Kristall, ein geordnetes Gitter von kolloidalen Teilchen mit variablem Durchmesser der einzigartigen Struktur des Gerüsts kann dem einfachen Herstellungsprozess zurückgeführt werden. Kurz gesagt werden die Verfahren zusammenzufassen, Partikel ordentlich angeordnet und unter Verwendung von Wärme geglüht ein Gitter zu bilden. Die Auslaugung dieses Gitters, durch ein organisches Lösungsmittel, in einem polymerisierten Hydrogels Ergebnisse in hexagonal gepackte kugelförmige Hohlräume 15 mit hoher Oberfläche. Diese hochgeordnete Gerüst sowohl mit synthetischen und natürlichen Materialien , die zuvor hergestellt wurde, einschließlich , aber nicht beschränkt auf Poly (acrylamid) , 16-21, Poly (milch-co-glykolsäure) 15,22-30, Poly (ethylenglykol) 31,32, Poly (2-hydroxyethylmethacrylat) 21,33-35, 36-39 und Chitosan. ICC Gerüste aus nicht-Fouling - Materialien neigen dazu , zelluläre Sphäroiden innerhalb der Hohlräume 14,23,40 zu fördern. Mehrere Zelltypen wurden 43,44 Zellen gezeigt, erfolgreich proliferieren, differenzieren und Funktion innerhalb dieser Konfiguration einschließlich Chondrozyten 41, Stromazellen des Knochenmarks 42 und einzudämmen. Bezug Hepatozyten wurden Untersuchungen mit ICC Scaffolds aus Na 2 SiO 3 und Poly (acrylamid), aber nicht PEG durchgeführt. Mit einfachen Biokonjugation Strategien (dh Aminkopplung durch EDC / NHS), ECM - Proteine ​​konjugierten PEG-Basis Gerüste hergestellt werden können, die mehr Zellbindungsstellen nachweisen kann , eine in - vivo - ähnliche Umgebung zu sein und die Leberfunktion zu verbessern. In diesem Manuskript und der damit verbundenen Video, wir ausführlich die Herstellung des ICC Gerüstunter Verwendung von Poly (ethylenglykol) diacrylat (PEGDA) Hydrogels und eines Polystyrolmikrokügelchens Gitter, optimiert für Hepatokarzinom (Huh-7,5) Kultur. Wir veranschaulichen die Unterschiede zwischen den im allgemeinen nicht klebende bare PEGDA ICC Gerüste und der kollagenbeschichteten PEGDA ICC Gerüsts in Bezug auf die Gerüsttopologie und Zellleistung. Die Lebensfähigkeit der Zellen und Funktion werden qualitativ und quantitativ gemessen Huh-7.5 Zellverhalten zu beurteilen.

<table><tbody><tr><td>0,2 ml PCR-Röhrchen</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td><td>Kochbeständiger</td></tr><tr><td>Gorilla Glue</td><td>Gorilla Glue, Inc.</td><td>Hängt vom Anbieter ab. Diese wurde in einem örtlichen Geschäft gekauft.</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td>Maße: 24 x 60 mm2</td></tr><tr><td>Polystyrol-Kugeln</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>Durchmesser = 140 &micro; m; 3x104 Partikel pro Milliliter und 1,4 % Größenverteilung</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1,00983,1011</td><td>absolut für die Analyse EMSURE; Verdünnung auf 70 % mit Milli-Q Wasser</td></tr><tr><td>Ultraschallbad</td><td>Elma</td><td>S10H</td><td></td></tr><tr><td>Geräteofen</td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>200 & Mikro; l Pipettenspitze</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelschüttler</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol (PEG)</td><td>Merck</td><td>1.09727.0100</td><td>Mw= 4 kDa; Durch die Acrylation von PEG-Monomeren und die Reinigung des resultierenden Niederschlags entsteht ein PEGDA-Makromer mit Mw = 4,6&nbsp; kDa</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Acrylat-Poly(ethylenglykol) - Succinimidylvalerat</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td><td>Mw = 3,4 kDa</td></tr><tr><td>2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinfilm</td><td>Parafilm M&nbsp;</td><td>#PM996</td><td>Gehalten bei 9" mit einer Intensität von 10,84&nbsp; mW/cm2</td></tr><tr><td>Bluewave 200 UV-Strahler</td><td>Blaze Technology&nbsp;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF)</td><td>Merck</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>Heidolph</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Ab Ratte 1x, ohne CaCl2 & MgCl2; pH = 7,2</td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16 % w/v aq. 10 x 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR</td><td>43368.9M</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Gefriertrockner</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Sputter Coater</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Primärantikörper gegen Kollagen Typ I</td><td>Abcam</td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Sekundärantikörper, konjugiert mit Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Platte, Gewebekultur 24 Well, flacher Boden (Nunklon)&nbsp;</td><td>Bio-Rev PTE Ltd</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 2,5 g/l Glukose w/ L-Gln</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Life Tchnologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Corning unbehandelte Kulturschalen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430591</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Geräte; 37&nbsp; &deg; C, 5% Luftfeuchtigkeit</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 Inkubatoren</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Bright-Line Phase Hämazytometer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Lebend/Tot Lebensfähigkeit/Zytotoxizität Kit für Säugetierzellen</td><td>Life Technologies</td><td>L3224&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Assay</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04-11</td><td>Mononatriumsalz-Reagenz (MSR)</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO Mikroplatten-Reader&nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin Human ELISA kit</td><td>Abcam</td><td>ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Primärantikörper (gegen CYP3A4, Albumin)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850; sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 markiert Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC Wasser</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c Spektralphotometer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transkription Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR select Master Mix für CFX</td><td>Life Technology</td><td>4472937</td><td></td></tr><tr><td>Primer (zur Auswahl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>SOFT-CFX-31-PATCH&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

die herstellung von inverted kolloid-kristallen poly (ethylenglycol) scaffold: eine dreidimensionale zellkultur-plattform für leber-tissue engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Die Fähigkeit Hepatozyten Funktion in vitro zu halten, zum Zweck der Xenobiotika &#39;Zytotoxizität testen, Virusinfektion zu studieren und an der Leber zielgerichtete Medikamente zu entwickeln, erfordert eine Plattform in dem Zellen richtige biochemische und mechanische Signale empfangen. Recent Lebergewebe-Engineering-Systeme haben dreidimensionale (3D) Scaffolds synthetischen oder natürlichen zusammengesetzt aus Hydrogelen, verwendet werden, aufgrund ihrer hohen Wasserretention und ihre Fähigkeit, die mechanische Reize von den Zellen benötigt, bereitzustellen. Es wurde in der umgekehrten kolloidalen Kristall (ICC) Gerüst, eine neuere Entwicklung, die eine hohe räumliche Organisation, homotypische und heterotypic Zell-Interaktion erlaubt, sowie zellextrazellulären Matrix (ECM) Wechselwirkung wachsendes Interesse. Hier beschreiben wir ein Protokoll des ICC-Gerüst unter Verwendung von Poly (Ethylenglycol) diacrylat (PEGDA) und die Partikel Auslaugung Verfahren herzustellen. Kurz gesagt, wird ein Gitter aus Mikrokügelchen-Partikel hergestellt, wonach eine vorge polymer Lösung hinzugefügt wird , richtig polymerisiert, und die Partikel werden dann entfernt oder ausgewaschen, mit einem organischen Lösungsmittel (beispielsweise Tetrahydrofuran). Die Auflösung der Gitter ergibt ein hochporöses Gerüst mit kontrolliertem Porengrößen und interconnectivities die Medien erlauben Zellen leichter zu erreichen. Diese einzigartige Struktur erlaubt hohe Oberfläche für die Zellen der PEGDA ICC Gerüst auch mit Proteinen sowie einfache Kommunikation zwischen den Poren, und die Fähigkeit zur Beschichtung anhaften zeigt eine deutliche Wirkung auf die Zellleistung. Wir analysieren die Morphologie des Gerüsts sowie die hepatocarcinoma Zelle (Huh-7.5) Verhalten in Bezug auf die Lebensfähigkeit und Funktion, um die Wirkung von ICC-Struktur und ECM-Beschichtungen zu erkunden. Insgesamt bietet dieses Papier ein detailliertes Protokoll einer sich abzeichnenden Gerüst, das breite Anwendungen im Tissue Engineering hat, hier vor allem technische Lebergewebe.

Die repräsentative Ergebnisse für die strukturelle Charakterisierung des ICC Gerüst und den Vergleich der einzelnen ICC Wirksamkeit des Gerüsts Zustand Hepatozyten in die Kultivierung sind unten dargestellt und erläutert. Die ICC Gerüstbedingungen in diesen Ergebnissen sind Kollagenbeschichtungen von 0 &amp; mgr; g / ml (Bare), 20 &amp; mgr; g / ml (Collagen 20), 200 &amp; mgr; g / ml (Collagen 200) und 400 ug / ml (Collagen 400) und dem anfänglichen huh-7.5 Zellaussaat Zahl ist 1x10 <su...

Dieses Manuskript präsentiert ein detailliertes Protokoll für die Herstellung einer entstehenden dreidimensionalen Hepatozytenkulturplattform, das invertierte kolloidale Kristallgerüst und die begleitenden Techniken zur Beurteilung des Verhaltens von Hepatozyten. Die größenkontrollierbaren Poren, die Interkonnektivität und die Fähigkeit, extrazelluläre Matrixproteine an das Poly(ethylenglykol) (PEG)-Gerüst zu konjugieren, verbessern die Leistung der Huh-7.5-Zelle.

Die Herstellung von Inverted Kolloid-Kristallen Poly (Ethylenglycol) Scaffold: Eine dreidimensionale Zellkultur-Plattform für Leber-Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung von PEG-basierten invertierten kolloidalen Kristallgerüsten mit einer extrazellulären Matrix, die für Anwendungen im Bereich des Lebergewebes Engineering codiert. Das Lebergewebes Engineering ist ein spannendes Forschungsfeld im Bereich des Gewebe Engineering und der regenerativen Medizin. Wir erstellen 3D-Engineering-Gerüste, die Leberzellen ermöglichen, ihre Funktion über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten.Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis hin zur Arzneimittelprüfung, da Leberzellen, die mit diesem System kultiviert werden, ihre Funktion möglicherweise länger beibehalten und besser auf Arzneimittel reagieren. Obwohl diese Methode Einblicke in das Gewebeengineering ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, beispielsweise solche, die Stammzellen verwenden. Das Verfahren wird von Hitomi demonstriert, einer Doktorandin aus meinem Labor.Um die Mikroperlenformen herzustellen, schneiden Sie zunächst die Spitzen von 0,2-Milliliter-kochfesten Mikrozentrifugenröhrchen auf der 40-Mikroliter-Markierung ab. Verwenden Sie wasserfesten Kleber, um die Oberseiten der abgeschnittenen Röhrchen auf Glasobjektträgern zu befestigen, und kleben Sie anschließend den Bereich um die Formen herum fest. Danach ersetzen Sie das Wasser in einem Gefäß mit Polystyrol-Mikrokügelchen durch 70 % Ethanol.Stellen Sie die Sphärenlösung in ein Ultraschallbad und beschallen Sie die Mischung drei Minuten lang mit 30 Watt, um die agglomerierten Sphären zu lösen. Sobald die Mikrosphären vorbereitet sind, pipettieren Sie 100 Mikroliter Ethanol in jede der Formen. Schneiden Sie anschließend vier Millimeter von der Spitze einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab und verwenden Sie diese, um zweimal jeweils 25 Mikroliter der Polystyrol-Mikrosphären in die Form zu pipettieren.Stellen Sie die Formen auf einen Schüttelapparat und stellen Sie diesen auf 120 U/min ein. Lassen Sie die Proben über Nacht auf dem Schüttler stehen. Am nächsten Tag stellen Sie die Formen unter ein Mikroskop und überprüfen Sie, ob die Kugeln hexagonal geordnet sind.Lassen Sie das Ethanol zwei Nächte lang bei Raumtemperatur verdunsten. Stellen Sie den Form- und Kugelkomplex anschließend vorsichtig sechs Stunden lang in einen Ofen bei 130 Grad Celsius, um die Polystyrolkugeln zu glühen und das Negative des 3D-Gerüsts zu bilden. Synthetisieren Sie zunächst Polyethylenglykoldiacrylat-Makromere mithilfe etablierter Protokolle, wie in diesen beiden Referenzen beschrieben.Bereiten Sie anschließend eine 50 %ige Lösung von PEGDA in entionisiertem Wasser vor und zentrifugieren Sie die Mischung, bis sie vollständig gelöst ist. Für mit extrazellulärer Matrix konjugierte Gerüste geben Sie zusätzlich 10 % eines PEG-NHS aus Krillöl zu der 50 %igen PEGDA-Lösung hinzu. Danach stellen Sie eine 20 %ige Stammlösung des Photoinitiators in 70 %igem Ethanol her.Fügen Sie pro Milliliter der PEGDA-Mischung 50 Mikroliter der Photoinitiatorlösung hinzu. Anschließend wirbeln Sie die Mischung eine Minute lang im Vortex. Danach lösen Sie die Formen vorsichtig von den Objektträgern ab, drücken die Gitter mit einem Spatel behutsam heraus und geben sie in separate 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Pipettieren Sie 300 Mikroliter der PEGDA-Lösung in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie anschließend die Röhrchen, um die Infiltration der PEGDA-Lösung in das Polystyrolgitter zu ermöglichen. Entfernen Sie danach das Gitter mit einer Pinzette aus dem Röhrchen und tupfen Sie vorsichtig überschüssige PEGDA-Lösung von der Oberfläche ab. Legen Sie das Gitter mit der flachen, runden Oberfläche nach oben auf eine mit Paraffinfolie bedeckte Glasplatte.Danach den Scaffold 5 Minuten lang mit einer UV-Flächenlampe 365 Nanometer ultraviolettem Licht aussetzen. Etwa zehn PEGDA-polymerisierte Kristallgitter in ein neues Gefäß geben und 20 Milliliter THF hinzufügen. Die Gefäße sechs Stunden lang auf einem Rotationsschüttler bei 300 U/min schütteln.Entfernen Sie das Vial alle ein bis zwei Stunden und tauschen Sie das polymerhaltige Lösungsmittel gegen frisches THF aus. Nach dem letzten Spülgang geben Sie Wasser zur verwendeten THF-Lösung hinzu, um zu überprüfen, ob die PS-Kügelchen vollständig gelöst sind. Wenn die Lösung weiß ist, führen Sie zusätzliche Spülgänge durch, bis die Lösung klar wird.Um die Gerüste zu sterilisieren, bereiten Sie ein 50-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Milliliter 70 %igem Ethanol pro Gerüst vor und geben Sie die Gerüste mithilfe einer Spatel in das Röhrchen. Lassen Sie die Gerüste eine Stunde lang im Ethanol einweichen. Nach einer Stunde gießen Sie das Ethanol vorsichtig ab und ersetzen es durch ein gleiches Volumen steriler PBS.Anschließend zentrifugieren Sie die Scaffolds, um eventuelle Blasen zu entfernen. Lagern Sie die zentrifugierten Scaffolds bei vier Grad Celsius und nehmen Sie sie alle ein bis zwei Stunden heraus, um die Lösung durch frische PBS zu ersetzen. Nach mehreren Wechseln der PBS entfernen Sie die Scaffolds, die mit Kollagen beschichtet werden sollen, und geben Sie sie in ein Gefäß mit einem Milliliter Kollagen Typ I pro zu beschichtendem Scaffold.Als Nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen wie zuvor und schütteln Sie die Scaffolds 30 Minuten lang mit 400 U/min auf einem Rotationsschüttler. Lagern Sie die Scaffolds über Nacht bei vier Grad Celsius. Kultivieren Sie Hepatokarzinomzellen in 100-Millimeter-Zellkulturschalen mit 10 Milliliter Kulturmedium.Erneuern Sie das Medium alle drei Tage, bis die Zelldichte 75 bis 80 % der Kulturoberfläche erreicht hat. Wenn die Zellen bereit sind, stellen Sie die Scaffolds vorsichtig mit der flachen Seite nach oben in eine 24-Well-Platte. Spülen Sie anschließend jeden Scaffold mit zwei Milliliter PBS aus.Entfernen Sie das PBS und geben Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium zu den Scaffolds hinzu. Nach 30 Minuten entfernen Sie das Medium und lassen den Scaffold eine Stunde lang trocknen. Danach gewinnen Sie die Hepatokarzinomzellen mittels Trypsinverdauung.Nachdem die Zellen pelletiert wurden, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet so, dass eine Million Zellen pro 25 Mikroliter vorliegen. Pipettieren Sie langsam 25 Mikroliter der Zellsuspension direkt auf jedes Gerüst. Danach decken Sie die Platte ab und stellen sie über Nacht in den Inkubator.Überführen Sie die Scaffolds anschließend vorsichtig in eine neue 24-Loch-Platte und pipettieren Sie zwei Milliliter Medium in jedes Loch, bevor Sie die Platte in den Inkubator zurückstellen. Ein Rasterelektronenmikroskopbild des Scaffolds ist hier dargestellt. Es besteht aus einer hexagonal dichtesten Packung von Poren mit einem Durchmesser von durchschnittlich 100 bis 105 Mikron, wodurch Verbindungen zu benachbarten Poren entstehen, deren Durchmesser größtenteils zwischen 35 und 40 Mikron liegt.Wenn Hepatozytenkarzinomzellen ausgesät werden, wachsen und proliferieren diese auf Gerüsten, die zuvor mit Kollagen Typ I beschichtet wurden, nehmen jedoch auf unbeschichteten Gerüsten nicht an Zahl zu. Außerdem zeigten die Hepatozytenkarzinomzellen auf den kollagenbeschichteten Gerüsten eine stärkere Zellfunktion in abhängiger Weise von der Konzentration. Am Tag 14 sekretierten die Hepatozytenkarzinomzellen, die auf ICC-Gerüsten mit einer Beschichtung von 400 Mikrogramm pro Milliliter kultiviert wurden, mehr als das Dreifache an Albumin im Vergleich zu den auf unbeschichteten Gerüsten kultivierten Zellen.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Polystyrolkugeln im Gitter ordnungsgemäß angeordnet sind. Eine schlechte Anordnung führt zu einer unzureichenden Vernetzung, was die Zellaktivität negativ beeinflussen kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie zilierte, PEG-basierte invertierte kolloidale Kristallgerüste mit einer Beschichtung hergestellt werden.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tetrahydrofuran gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Abzug sowie das Tragen von Handschuhen und Schutzbrille, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Erfahren Sie die Herstellung von PEG-basierten inversen kolloidalen Kristallscaffolds für Lebergewebe-Engineering. Diese Methode ermöglicht längere Aufrechterhaltung der Hepatozytenfunktion und verbessert Anwendungen in der Arzneimittelprüfung.

Die Herstellung von Inverted Kolloid-Kristallen Poly (Ethylenglycol) Scaffold: Eine dreidimensionale Zellkultur-Plattform für Leber-Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal

Die Herstellung von Inverted Kolloid-Kristallen Poly (Ethylenglycol) Scaffold: Eine dreidimensionale Zellkultur-Plattform für Leber-Tissue Engineering

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