Sinyal Proteinlerin Fonksiyonu taklit: Yapay Sinyal İletimi Tedavisi Doğru

Bu deneyin genel amacı, sentetik bir kimyasal dönüştürücü tarafından indüklenen iki protein arasındaki doğal olmayan iletişimi spektroskopik olarak takip etmektir. Doğada bulunmayan sinyal iletim yollarını gerçekleştirebilecek sinyal proteinlerinin sentetik analoglarının geliştirilmesi olasılığını gösterecektir. Ortak spektrofotometre ile doğal olmayan proteinden proteine iletişimi takip etme yeteneği, yapay kimyasal dönüştürücülerin işlevini geliştirmeye ve iyileştirmeye yardımcı olabilir ve bizi yapay sinyal iletim terapisine ulaşmaya daha da yaklaştırabilir.

Kimyasal dönüştürücü, trombositten türetilmiş bir büyüme faktörü veya PDGF aptamerinden oluşur. İki değerlikli bir etakrinik amid GST inhibitörü, bir florofor ve bir söndürücü. Kimyasal dönüştürücünün sentezi bu videoda gösterilmeyecektir.

Ancak metin protokolünde açıklanmıştır. Kimyasal dönüştürücünün çalışma prensipleri burada gösterilmiştir. Kimyasal dönüştürücü, iki EA grubu enzimlerin aktif bölgelerini bağladığında GST'nin enzimatik aktivitesini inhibe eder.

PDGF'nin eklenmesi, PDGF kimyasal dönüştürücü kompleksinin oluşumuna yol açar. Bu, dönüştürücü-GST etkileşimini bozar, bu nedenle GST enzimatik aktivitesini geri yükler. Değiştirilmemiş bir PDGF aptamerinin aşağıdaki ilavesi, kimyasal dönüştürücüyü serbest bırakır ve enzimi yeniden inhibe etmesine izin verir.

PDGF ile GST aktivitesinin kontrolünü incelemek için deneylere başlamadan önce, kinetik ölçüm için plaka okuyucuda deneysel bir prosedür oluşturun. Standart bir protokol olarak yeni bir deney oluşturun. Prosedür Ayarları penceresini açmak için Prosedür'ü seçin.

Pencerenin üst tarafındaki açılır listede, plaka üreticisine göre 384 Plaka Tipini seçin. Soldaki menüden Oku'yu seçin. Algılama yöntemi için absorbans'ı seçin.

ve okuma türü için uç nokta. Dalga Boyu penceresinde 340 nanometre yazın. Tam Plaka'yı seçin ve ölçülecek kuyuları seçin.

Ardından Oku penceresini kapatmak için Tamam'a tıklayın. Soldaki menüde Kinetiği Başlat'ı seçin. Çalışma Süresi'ni 10 dakika olarak ayarlayın.

Minimum Aralıklar seçeneğini seçin. Ardından Kinetik penceresini kapatmak için Tamam'a tıklayın. Okuma Satırı'nı Kinetik Ölçüm'e sürükleyin.

Doğrula düğmesini ve ardından Tamam düğmesini seçin. Denemeyi kaydedin. Oynat düğmesini seçin.

Bir iletişim kutusu görünecektir, ancak kinetik ölçümü başlatmaya hazır olana kadar Tamam düğmesini seçmeyin. Plaka okuyucu kurulduktan sonra, bir sonraki adım, kimyasal dönüştürücü ve PDGF varlığında GST aktivitesini ölçmek için numuneleri hazırlamaktır. Dört PDGF konsantrasyonunu üç kopya halinde test etmek için, her biri 3.25 mikrolitre kimyasal dönüştürücü ve 3.25 mikrolitre GST M-1 içeren dört numune hazırlayın.

Her numuneye sırasıyla sıfır, 1.2, 2.4 veya 4.9 mikrolitre PDGF ekleyin. Ardından, toplam hacmi 130 mikrolitreye çıkarmak için her numuneye uygun hacimde tahlil tamponu ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

10 dakika sonra, her numuneden 40 mikrolitreyi 384 şeffaf kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Dört numunenin her birini yalnızca aynı sıradaki tek veya çift kuyucuklara aktarın. Alt tabaka ilavesi için çoklu pipetleyici kullanımına izin vermek için.

Daha sonra, daha önce 96 oyuklu bir plakada hazırlanmış olan her bir alt tabakadan 10 mikrolitreyi her numuneye hızlı bir şekilde eklemek için 12 kanallı bir çoklu pipetleyici kullanın. Kabarcıkları önlemek için hızlı ama nazikçe karıştırın. Plakayı hemen plaka okuyucuya yerleştirin ve iletişim kutusundaki OK düğmesini seçerek kinetik ölçümü başlatın.

Kimyasal dönüştürücünün aracılık ettiği GST aktivasyon inhibisyon döngülerini incelemek için, her biri 84.5 mikrolitre tahlil tamponu içeren beş numune hazırlayın. 3.25 mikrolitre kimyasal dönüştürücü ve 3.25 mikrolitre GST M1-1. Oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin.

Birinci numuneye 3.65 mikrolitre tahlil tamponu ve iki, üç, dört ve beş numuneye 3.65 mikrolitre PDGF ekleyin. Oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Bir ve ikinci numunelere 3.12 mikrolitre tahlil tamponu ve üç, dört ve beşinci numunelere 3.12 mikrolitre PDGF aptamer ekleyin.

Oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Bir, iki ve üç numunelere 24.4 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Ve dördüncü ve beşinci numuneler için 24.4 mikrolitre PDGF.

Oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Bir ila dört numuneye 7.8 mikrolitre tahlil tamponu ve beşinci numuneye 7.8 mikrolitre PDGF aptamer ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Numuneleri 384 şeffaf kuyucuklu bir plakaya aktarın. Deneyi üç nüsha halinde gerçekleştirmek ve alt tabakayı numunelere hızlı bir şekilde eklemek için. Plakayı okuyucuya yerleştirin ve kinetik ölçümü başlatın.

Bu tahlillere başlamak için, protokol metninde açıklandığı gibi kinetik ölçüm için plaka okuyucuda deneysel bir prosedür oluşturun. 384 şeffaf kuyucuklu bir plakanın iki oyuğunda iki numune hazırlayın. Her kuyucuk için, bir mikrolitre GST M1-1 ve bir mikrolitre kimyasal dönüştürücüyü 38 mikrolitre tahlil tamponunda karıştırın.

İki kuyu arasında boş bir kuyu bırakın. 12 kanallı bir çoklu pipetleyici kullanarak, her bir oyuğa hızlı bir şekilde 10 mikrolitre alt tabaka ekleyin. Kabarcıkları önlemek için nazikçe ve hızlı bir şekilde karıştırın.

Plakayı hemen okuyucuya yerleştirin ve kinetik ölçümü başlatın. Plaka okuyucu 3,5 dakika sonra açıldığında, kuyucuklardan birine hızlı bir şekilde 1,125 mikrolitre PDGF ekleyin, hafifçe karıştırın ve kalan kinetik ölçümler için plakanın okuyucuya tekrar girmesine izin verin. Bu deney için numuneleri hazırlamadan önce, protokol metninde açıklandığı gibi kinetik ölçüm için plaka okuyucuda deneysel bir prosedür oluşturun.

Nitrik oksit üretimini ölçmek için bir nitrit/nitrat kolorimetrik kiti kullanılacaktır. 96 oyuklu bir plakada, ilk sıraya oyuk başına 50 mikrolitre tahlil tamponu dağıtın. İkinci sıraya oyuk başına 70 mikrolitre Griess Bir Reaktif.

Ve üçüncü sıraya oyuk başına 70 mikrolitre Griess İki Reaktif. Her biri 4.8 mikrolitre kimyasal dönüştürücü içeren dört numune hazırlayın. Birini örneklemek için 155.2 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin.

İkinci örneğe göre 3,2 mikrolitre GST M1-1 ve 152 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Üçünü örneklemek için 9.6 mikrolitre PDGF ve 145.6 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Ve dördü örneklemek için 3.2 mikrolitre GST M1-1, 9.6 mikrolitre PDGF ve 142.4 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin.

Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Deneyi üç kopya halinde gerçekleştirmek için 384 şeffaf kuyucuklu bir plakada oyuk başına 50 mikrolitre numune dağıtın. Alt tabaka ilavesi için çoklu pipetleyicinin kullanılmasına izin vermek için numuneleri yalnızca aynı hattaki tek veya çift kuyucuklara dağıtın.

Her numuneye 0.54 mikrolitre JS-K ön ilaç ekleyin. Her numuneye hızlı bir şekilde 10 mikrolitre glutatyon çözeltisi ekleyin ve kabarcıkları önlemek için nazikçe ve hızlı bir şekilde karıştırın. Plakayı okuyucuya yerleştirin ve kinetik ölçümü başlatın.

Kinetik ölçümden hemen sonra, her numuneden 50 mikrolitreyi, tahlil tamponu ile 96 kuyulu plakanın ilk sırasının her bir oyuğuna aktarın. Daha sonra, plakanın ikinci sırasının her bir oyuğundan 50 mikrolitreyi plakanın ilk sırasının kuyularına aktarın. Ve plakanın üçüncü sırasından plakanın ilk sırasının kuyularına kuyu başına 50 mikrolitre.

Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ışıktan koruyarak inkübe edin. Absorbansı 550 nanometrede ölçmeden önce. Kimyasal dönüştürücü olmadan ve kimyasal dönüştürücü ile GST aktivitesinin ölçülmesi, kimyasal dönüştürücünün GST aktivitesini inhibe ettiğini gösterdi.

GST, GST-kimyasal dönüştürücü kompleksine artan PDGF konsantrasyonlarının eklenmesiyle yeniden etkinleştirilir. PDGF'nin ardışık eklemeleri ve GST-kimyasal dönüştürücü kompleksine değiştirilmemiş bir PDGF aptameri, PDGF ve GST arasındaki iletişimin geri dönüşümlü olduğunu ortaya koydu. PDGF'nin GST dönüştürücü kompleksine eklenmesi, substratların eklenmesinden 3,5 dakika sonra GST aktivitesinde hızlı bir artışa neden oldu.

GST, PDGF ve kimyasal dönüştürücü karışımına bir PDGF aptamer eklenmesi, GST aktivitesinde bir azalmaya neden olurken. Bu sonuçlar, sistemin ortamındaki değişikliklere gerçek zamanlı olarak yanıt verdiğini göstermektedir. Daha sonra, bu sistemin ön ilaç aktivasyonunu kontrol etme yeteneği, toksik nitrik oksit salmak için GST tarafından aktive edilen bir anti-kanser ön ilacı olan JS-K kullanılarak araştırıldı.

Kimyasal dönüştürücüye JS-K eklenmesi ve GST ve PDGF'nin farklı kombinasyonları üzerine salınan nitrik oksit miktarlarının ölçümleri, yalnızca hem GST hem de PDGF'nin varlığının JS-K'yi aktive ettiğini doğruladı. Tüm bunlar, sentetik bir ajanın, doğal enzim ortağı olmayan Glutatyon S-Transferazın katalitik aktivitesini tetiklemek için bir büyüme faktörünü nasıl sağlayabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, bu sınıfın gelecekteki biyomimetikleri, hücrelerin çevresel sinyallere tepkisini değiştirmek veya onlara yeni özellikler kazandırmak için kullanılabilir.