Количественное измерение относительных уровней ретиноевой кислоты в E8.5 эмбрионы и нейросфера культур Использование F9 RARE-LacZ клеток на основе Reporter Assay

Общая цель этой процедуры заключается в количественном измерении относительных уровней ретиноевой кислоты в тканевых препаратах, таких как эмбрионы мышей E8.5 или взрослые нейросферные культуры, с использованием клеточного репортерного анализа. В то время как сигнальный путь РА хорошо охарактеризован, прямое гистологическое измерение РА технически невозможно. Этот анализ может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как генетические мутации могут влиять на уровень РА.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обладает высокой чувствительностью и универсальностью, с возможностью измерения широкого диапазона концентраций РА в различных образцах тканей. Хотя этот метод может дать прямое представление об определении уровней РА в различных образцах тканей, он также может быть применен к другим исследованиям, таким как определение наличия или отсутствия метаболических ферментов РА путем мониторинга изменений уровней РА. Прежде чем начинать какие-либо эксперименты, проверьте реакцию клеток F9 RARE-LacZ на РА. Добавьте один наномоляр all-trans RA к клеткам F9 RARE-LacZ, помещенным в 96-луночный планшет.

Затем инкубируйте планшет и культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день проведите окрашивание LacZ и проверьте клетки на наличие синего осадка. Если цвет не равномерный по всем ячейкам, приступайте к субклонированию ячеек.

Разделите выбранные культуры на 10-сантиметровые чашки по 100 000 клеток на 10 миллилитров. После двух дней культивирования приготовьте 24-луночную пластину с 500 микролитрами 0,2% желатина на лунку и оставьте пластину при комнатной температуре на 30 минут. Затем удалите желатин, и дважды промойте лунки 500 микролитрами дистиллированной воды.

Теперь добавьте в лунки 500 микролитров среды для культивирования клеток F9 RARE-LacZ. Затем выберите колонии клеток F9 с помощью стерильного наконечника для пипетки P10 и перенесите каждую в одну лунку. После трех или четырех дней культивирования разделите колонии на две покрытые желатином 24-луночные планшеты, одну для тестирования, а другую для расширения.

После еще двух дней культивирования добавьте по одному наномоляру RA в каждую лунку одного 24-луночного планшета и культивируйте его на ночь. На следующий день проведите окрашивание LacZ, чтобы проверить наличие пациентов с высоким уровнем чувствительности и расширить соответствующую культуру. За день до сбора эмбрионов E8.5 или диссоциации нейросфер покройте 96-луночный планшет 100 микролитрами 0,2% желатина на лунку и оставьте планшет на 30 минут.

Затем отсадите желатин и дважды промойте лунки 200 микролитрами дистиллированной воды. Далее трипсинизируйте выбранные клетки F9 RARE-LacZ, содержащиеся в 10-сантиметровых чашках. Затем поместите 100 000 клеток в каждую лунку 96-луночного планшета с использованием питательной среды без G418.

Загрузите достаточное количество лунок для совместного культивирования каждого эмбриона или подготовьте три лунки для каждого генотипа, если вы работаете с нейросферами. Также подготовьте 24 лунки для стандартной кривой. Затем инкубируйте тарелку в течение 24 часов.

Для совместного культивирования эмбриональных клеток начните препарирование эмбрионов E8.5. Затем загрузите в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра 10 микролитров трипсина и, используя наконечник пипетки P20 с расширенным отверстием, перенесите весь эмбрион в пробирку и поместите пробирку на лед. После того, как все эмбрионы будут изолированы, инкубируйте все пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы диссоциировать ткани.

Через пять минут аккуратно разомните содержимое каждой пробирки с помощью наконечника для пипетки P20 и перелейте 10 микролитров в лунку подготовленного 96-луночного планшета с ячейками F9 RARE-LacZ. Заквашивайте тарелку на ночь. Для кокультур нейросферы начните с переноса культуры нейросферы в 15-миллилитровые пробирки.

Вращайте пробирки при давлении 200 г в течение 10 минут и удалите все надосадочные жидкости, кроме одного миллилитра. Затем разомните содержимое с помощью пипетки P1000. Теперь используйте небольшой объем для определения плотности диссоциированных клеток.

Затем на пластине 100 000 диссоциированных клеток нейросферы над клетками F9 RARE-LacZ. Загрузите по три лунки с каждым типом культуры нейросферы. Теперь обязательно подготовьте лунки к стандартной кривой.

В трех экземплярах добавьте 100 микролитров растворов all-trans RA, полученных последовательным разведением в семи различных концентрациях, в питательную среду F9 RARE-LacZ. Включите негативный контроль необработанных клеток. Наконец, заквашивайте полностью загруженный 96-луночный планшет на ночь.

На следующий день удалите среду и зафиксируйте культуры, используя 100 микролитров 2,5% глутаральдегида на лунку. Дайте тарелке понервироваться при комнатной температуре в течение 15 минут. Позже снимите фиксатор и дважды промойте лунки 200 микролитрами PBS в течение 10 минут на промывку.

Далее трижды промойте лунки 200 микролитрами раствора для промывки LacZ в течение 10 минут на одну промывку. Во время третьей стирки приготовьте раствор для окрашивания X-gal в тубе объемом 15 миллилитров, завернутой в фольгу. Также подготовьте увлажненную камеру для 96-луночной пластины.

Теперь добавьте по 200 микролитров раствора для окрашивания X-gal в каждую лунку. Поместите тарелку внутрь увлажненной камеры, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации удалите окрашивающий раствор LacZ и замените его 200 микролитрами PBS.

Затем измерьте поглощение на 610 нанометрах и сфотографируйте пластину. Линия репортерных клеток F9 RARE-LacZ состоит из адгезивных клеток эмбриональной карциномы, которые количественно реагируют на РА с пропорциональной индукцией бета-галактозидазы. Они также имеют морфологию эпителия.

Несмотря на культивирование с помощью селекции G418, реакция этих клеток на РА будет ослабевать с несколькими пассажами. Таким образом, периодическое субклонирование необходимо для обеспечения сильных и равномерных ответов на РА. Ожидается, что эмбрионы E8.5, гомозиготные по мутации vl в Gpr161, будут демонстрировать сниженную передачу сигналов эмбрионального RA. С использованием описанного ко-культурального анализа диссоциированных эмбрионов с клетками F9 RARE-LacZ это ожидание было подтверждено.

Совместное культивирование нейросфер взрослого происхождения дикого типа с клетками F9 RARE-LacZ также было использовано для тестирования на РА в культурах нейросферы. Повышенное окрашивание, по сравнению с клетками стадии Е8.5, может быть связано с гомогенностью культур нейросферы. Путем создания стандартной кривой для уровней РА уровень РА был количественно определен в культурах нейросферы дикого типа и в эмбрионах E8.5.

Пытаясь выполнить эту процедуру, не забывайте поддерживать с помощью периодического субклонирования F9 клетки RARE-LacZ, которые сильно реагируют на РА. Кроме того, обязательно тщательно диссоциируйте образец, чтобы обеспечить однородное распределение и последовательное измерение РА. После этой процедуры можно исследовать влияние генетических мутаций на уровни РА, а затем использовать другие методы для изучения того, какие компоненты сигнального пути РА непосредственно затронуты.