신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여

이 절차의 전반적인 목표는 클론 조건에서 신경구 형성 및 분화를 사용하여 주어진 집단에서 신경 줄기 세포 빈도를 열거하는 것입니다. 이 방법은 후보 신경 줄기 세포 마커 평가, 신경 줄기 세포 정제 및 신경 줄기 세포와 신경 전구 세포를 구별하는 것과 같은 신경 줄기 세포 분야에서 주요 유틸리티를 가지고 있습니다. 이 방법의 장점은 수행하는 데 13일이 소요된다는 것인데, 이는 신경 줄기 세포 빈도를 수치화하는 현재 방법보다 짧고 클론 조건에서 수행된다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 1일차에 DMEM F12 배지를 B27, EGF, BFGF 및 페니실린 스트렙토마이신과 결합하여 NSC 성장 배지를 준비합니다. 다음으로, 실온에서 7분 동안 1ml의 NSC 성장 배지와 1ml의 0.05 일반 수산화나트륨으로 E14.5 마우스 신경구를 해리합니다. 세포를 때때로 위아래로 피펫팅하여 현탁액 상태로 유지한 다음 0.05 일반 염산 1ml를 첨가하여 알칼리를 중화합니다.

그런 다음 트리판 블루 염색과 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. 이 시드를 따라 96웰 접시에 100마이크로리터의 NSC 성장 배지에서 밀리리터당 50개 세포 이하의 밀도로 단일 E14.5 마우스 신경구 세포를 만듭니다. 세포를 섭씨 37도, 5%CO2에서 일주일 동안 배양하여 클론 신경구를 생성합니다.

조절된 배지에 대한 신경구를 배양하기 위해, 3일차에 E14.5 마우스 신경구를 해리하고 10cm 배양 접시에 있는 10밀리리터의 NSC 성장 배지에 20, 000개의 세포의 밀도로 단일 세포를 파종합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도, 5%CO2에서 5일 동안 배양하여 벌크 배양된 신경구를 생성합니다. 8일차에 700마이크로리터의 0.01%폴리-L-라이신, 70마이크로리터의 라미닌을 혼합하여 코팅 용액을 준비하고 밀리리터당 1밀리그램과 6, 230마이크로리터의 PBS를 추가합니다.

다음으로, 10cm 배양 접시에 7ml의 폴리-L-라이신 라미닌 용액을 섭씨 37도에서 2시간 동안 코팅합니다. 10ml 혈청학적 피펫을 사용하여 벌크 배양된 모든 신경구를 15mm 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 신경구를 실온에서 1분간 171배로 원심분리하고 초팽창을 완전히 제거합니다.

그 후, DMEM F12 배지와 B27 및 FBS를 결합하여 NSC 분화 배지를 준비합니다. 10ml의 NSC 분화 배지를 신경구에 추가하고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 신경구를 재현탁합니다. 그런 다음 10cm 배양 접시에서 폴리-L-라이신 라미닌을 흡인하고 10ml의 PBS로 한 번 세척합니다.

모든 신경 영역을 폴리 L- 라이신 라미닌 코팅 10cm 배양 접시로 옮기고 신경 영역이 접시에 부착 될 수 있도록 섭씨 37 도, 5 % CO2에서 밤새 배양합니다. 여덟 번째 날에는 현미경으로 각 웰에 형성된 신경구의 수를 세고, 50개의 웰 챔버가 있는 커버 슬립의 각 웰에 10마이크로리터의 폴리-L-라이신 라미닌 코팅 용액을 섭씨 37도에서 2시간 동안 코팅합니다. 다음으로, 각각 30ml의 PBS가 들어 있는 50ml 원뿔형 원심분리기 튜브 3개를 준비합니다.

멸균 집게를 사용하여 코팅된 50 웰 챔버 커버 슬립을 제거하고 챔버 커버 슬립을 PBS의 첫 번째 튜브에 담근 다음 두 번째 튜브와 PBS의 세 번째 튜브를 밀어 코팅 용액을 씻어냅니다. 그 후, 챔버 커버 슬립의 우물에서 남아 있는 액체를 흡인합니다. 96개의 웰 접시의 각 웰에서 모든 매체 및 신경 구체를 하나의 10cm 배양 접시로 부드럽게 옮깁니다.

현미경으로 피펫 컬럼을 2마이크로리터로 설정하여 매번 하나의 신경구만 선택하도록 하고, 10마이크로리터 피펫 팁이 장착된 P10 마이크로 피펫을 사용하여 샘플 신경구를 선택합니다. 신경구체는 현미경으로 채집하거나, 층류 후드에 배치하거나, 벤치 상단에 놓을 수 있습니다. 그런 다음 신경구를 코팅된 50개의 우물 챔버 커버 슬립의 우물 중앙으로 옮깁니다.

챔버 커버 슬립의 각 웰에 신경구가 포함될 때까지 절차를 반복합니다. 그 후, 10마이크로리터의 NSC 분화 배지를 챔버 커버 슬립의 각 웰에 첨가합니다. 챔버 커버 슬립을 10cm 배양 접시에 놓습니다.

10cm 접시에 최대 2개의 챔버 커버 슬립을 넣을 수 있습니다. NSC 분화 배지의 건조를 방지하기 위해 접시 가장자리를 따라 PBS를 피펫으로 만듭니다. 챔버 커버 슬립을 섭씨 37도, 5%CO2에서 밤새 배양합니다.

9일차에 벌크 배양된 신경구에서 조절된 배지를 15ml 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 20ml 멸균 주사기를 사용하여 컨디셔닝된 매체를 0.2마이크로미터 필터에 통과시켜 세포나 파편을 제거합니다. 그런 다음 여과된 컨디셔닝 배지를 10cm 배양 접시에 다시 옮깁니다.

그런 다음 멸균 집게를 사용하여 챔버 커버 슬립을 샘플 신경구가 아래쪽을 향하도록 거꾸로 조절된 매체에 부드럽게 놓습니다. 챔버 커버 슬립을 섭씨 37도, 5%CO2에서 3일 동안 배양합니다. 12일째에는 멸균 집게를 사용하여 10cm 배양 접시에서 챔버 덮개 슬립을 부드럽게 제거합니다.

커버 슬립을 PBS에 부드럽게 담그어 컨디셔닝된 매체를 씻어냅니다. 그런 다음 커버 슬립에서 실리콘 개스킷을 떼어내고 커버 슬립이 파손되지 않도록 부드럽고 천천히 수행하십시오. 분화된 신경구체가 부착되어 있는 면을 주목하십시오.

그 후, 4 % 파라 포름 알데히드의 1 밀리미터를 커버 슬립 크기로 자른 파라핀 필름 조각에 피펫으로 만듭니다. 파라포름알데히드와 접촉하여 신경구가 아래쪽을 향하도록 파라핀 필름에 커버 슬립을 부드럽게 놓고 실온에서 20분 동안 신경구를 고정합니다. 여기에서 단일 신경구를 선택하고 3일 동안 50개의 웰 챔버 커버 슬립에서 분화했습니다.

이것은 dapi로 염색되고 GFAP, TUJ1 및 O4에 대해 면역 염색된 삼중 전능 신경구의 대표적인 이미지입니다. 이 이미지는 dapi GFAP, TUJ1 및 O4의 오버레이를 보여줍니다. 이 프로토콜은 알려진 NSC 마커인 LeX의 NSC 농축 능력을 평가하는 데 사용됩니다. 이 그래프는 LeX 양성 세포와 LeX 음성 세포에 의해 생성된 단전능, 양전분능 및 삼중전능 신경구의 비율을 보여줍니다. 그리고 LeX 양성 세포는 LeX 음성세포보다 훨씬 더 많은 삼분화능 신경구를 생성합니다.

이 표는 LeX 양성 세포와 LeX 음성 세포의 NSC 빈도가 NFU와 삼중전능 신경구의 비율의 곱으로 계산되었음을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경 줄기 세포 빈도를 열거하기 위해 클론 조건에서 신경구를 배양하고 분화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 방법을 수행하는 동안 신경구에 대한 최적의 성장 및 분화 조건을 보장하기 위해 갓 준비된 성장 및 분화 매체와 갓 준비된 코팅 용액을 사용하는 것이 중요합니다.

이 방법을 숙달하면 13일 만에 수행할 수 있으며, 이는 신경 줄기 세포 빈도를 열거하는 현재 방법에 비해 짧은 시간입니다. 이 방법은 새로운 줄기세포를 농축하고 결정적인 신경줄기세포 마커를 식별하기 위해 신경 집락 형성 세포 분석과 같은 현재 방법과 함께 사용할 수 있습니다.