細胞の表面のガイダンスとBioprintingための自動ロボット調剤技術

この自動ロボット分注技術の全体的な目的は、細胞の地形学的ガイダンスのための表面を作成し、プログラムされたパターンに従ってこれらの形状に細胞を配置することで、細胞の挙動と分布を制御することです。この手法は、単一培養および共培養の両方において、表面のトポロジーが細胞の挙動にどのような影響を与えるかという、生物医学工学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、より確立された手法と比較して、細胞ガイダンスパターンのプログラミングとプリントに要する時間が短縮されることです。

また、制御された分注のための細胞デリバリー工程も含まれています。ハイドロゲル中に配置された細胞の2Dパターンが表面ガイダンスの恩恵を受けられることに気づいたとき、私たちは最初にこの手法を考案しました。そのため、表面の特徴に一致させる方法でハイドロゲルをプリントするこの技術を開発しました。

本プロトコルでは、表面エッチングおよび押出ベースのバイオプリンターとして、背圧支援ロボットディスペンシングシステムを使用する方法について説明します。エッチングおよび印刷用のポリスチレン表面を準備するために、厚さ1 mmのポリスチレンシートを選択してください。シートがより厚いと、より大きく反ります。

次に、シートを酸素プラズマ処理します。酸素ガスレギュレーターを2 barに設定します。その後、プラズマ装置のスイッチを入れ、真空ポンプを起動します。

装置を150 W、酸素ガス流量 30 sccmに設定し、シートを10分間これらの条件下で処理します。その後、チャンバー内を排気してドアを密閉し、サイクルを開始します。次に、処理したシートを純粋なウシ胎児血清に浸し、37 °Cで2時間、撹拌しながらインキュベートします。

セラム処理後、シートを1X PBSで3回洗浄し、滅菌します。最後の洗浄後、シートを37 °Cのオーブンに入れ、約12時間一晩乾燥させます。次に、エッチング用のプリンティングスタイラスを準備します。

慎重に、直径1.5 millimeterのテキスタイル針をディスペンシングシリンジのノズルに、しっかりとはまり込んで固定されるまで挿入します。バイオプリントによる配置を初めて作成する場合は、番号付きの軸がある方眼紙に希望のパターンを描き、x、y座標を作成します。その後、パターンの座標をスプレッドシートに入力してください。

次に、プリンティングソフトウェアで [Program]、[Add Program] を選択し、続いて [Edit]、[Add Point] を選択してプログラムを作成します。その後、スプレッドシートからxおよびyの座標値をプリント分注ソフトウェアにコピーします。各ランの前に、ロボットのz方向の高さを校正し、スタイラスの接触位置を設定してください。

まず、「Robot」オプションを選択します。次に、「Changing Mode」をクリックし、「Teaching Mode」オプションを有効にします。これにより、ロボットのJOG機能が有効になります。

ロボットをJOG操作するには、まず「Robot」から「Meca Initialize」を選択し、ロボットをデフォルト位置に戻します。次に、「Robot」から「JOG」を選択します。続いて、xおよびyのスロットに、スタイラスをパターンの原点に正確に配置するために必要な距離をミリメートルで入力します。

次に、zスロットにミリメートル単位で数値を入力し、表面を撓ませたり押し込んだりすることなく、スタイラスまたはノズルが表面に接触するように配置します。これをzの開始値として指定します。zの高さを用いることで、各溝の深さを調整することが可能です。

例えば、切削溝の深さは40、80、または170 µmとなる可能性があります。スタイラスのしなりや表面への顕著な食い込みがない接触点を見つけるには、集中力と綿密な観察が必要です。確実に成功させるために、数枚のシートを用意し、異なるz高さでプログラムを実行して、最適な開始位置を特定することを推奨します。

次のステップは、各座標点に対するプリント指示を定義することです。「Start of Line Dispense」を使用して最初の点とプリントの開始を定義します。次に、「Line Passing」を使用して中間点を指定し、最後に「End of Line Dispense」を使用して、ロボットにプリントランを終了させる信号を送ります。

プログラムをロボットに転送するには、[Robot]から[Send C&T Data]を選択します。次に、[Robot]、[Changing Mode]、[Switch Run Mode]の順に選択し、設定を[Run]に切り替えて実行を開始します。最後に、プリンティングを開始してください。

バイオインクを調製するために、10% FBSおよび2% 抗生物質・抗真菌剤を添加したAlpha MEMに2% ゼラチンを溶解させます。ゼラチンを培地中に溶解させるため、培地を60 °Cで2時間静置します。バイオインクに使用する細胞を、10 cmディッシュでコンフルエンシー70%まで培養します。

表面ガイダンス構造に反応する細胞であればどのような細胞でも使用可能であり、包埋プロセス中に視認できるよう、蛍光ラベルを発現させておく必要があります。培地を除去し、PBSで細胞を洗浄した後、1X Trypsin-EDTA溶液を用いて37 °Cで5分間処理することで、接着している細胞を懸濁液中に遊離させます。培地でTrypsinを中和した後、細胞を懸濁液として回収し、1,000 gで5分間遠心分離してペレット化します。

上清を除去し、0.5 millilitersの培地で細胞を再懸濁します。細胞密度を測定した後、懸濁液を冷却したバイオインク溶液に混ぜ合わせ、1 millimeterあたり500万個の細胞を含む溶液を作成します。次に、ルアキャップで塞いだ準備済みのプリンティングシリンジに、細胞含有バイオインクを注入します。

プリント可能な粘度に調整するため、充填済みのシリンジを4 °Cで冷却します。次に、冷却した充填済みシリンジを取り出し、キャップを外してプリントノズルを取り付けます。その後、充填済みシリンジをディスペンシングシステムに装着し、空気圧ラインに接続します。

バイオインクを設計済みのパターンにプリントするためには、エッジとラインを明確にする必要があります。正確なプリントを実現するには、ディスペンサーの背圧とプリントノズルの針ゲージを最適化します。34ゲージのテーパー針を用いた10ミリリットルシリンジの場合、ディスペンサーの背圧を0.05メガパスカルに設定してください。

次に、ソフトウェアで書き込み速度を5 mm/sに設定し、ポリスチレンフィルム表面に書き込みます。プログラムされたパターンに従い、細胞含有バイオインクをあらかじめエッチングした溝に堆積させます。細胞を堆積させた後、シートを室温で20分間インキュベートします。

その後、プリントした細胞スキャフォールドを適切な培地で満たし、さらなる実験の前に細胞が付着するように24時間培養します。バイオインクを用いてバイオプリンティングにより播種された幹細胞は、最終的に表面に沈降し、微細にエッチングされたラインの方向に沿って感知し、伸長しました。バイオプリンティングを用いずに培地中で播種された細胞も同様に、構造物の方向に沿って配向しました。

しかし、それらは表面全体を覆っていたため、バイオインクによって細胞はプリントされたトレース内に制限されました。エッチング加工されていないシートに播種した場合、細胞に配向性や整列は見られませんでした。このビデオを視聴することで、ポリスチレンシートに溝を精密にエッチングし、その溝の中に細胞を精密にバイオプリントする方法について十分に理解できるはずです。

この技術に習熟すれば、約2〜3時間で完了できます。細胞の異方性と配置が必要なモデルにおいて、細胞表面の相互作用を明らかにしたいバイオエンジニアリング分野の研究者にとって非常に有用です。バイオインクには生細胞が含まれているため、シートをプリントする際は無菌操作を行うことが非常に重要であることに留意してください。