Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes ist es, die Leberbesiedlung durch metastasierende Tumorklone, die durch kolorektale Karzinome erzeugt werden, zu modellieren und dieses Modell zur Verbesserung der Diagnostik und Therapie von Lebermetastasen zu nutzen. Klinische Beobachtungen deuten auf die Heterogenität der metastasierten Erkrankung hin. Unser Modell bietet die Möglichkeit, diese Heterogenität zu erfassen, um Gene zu erkennen, die mit oligometastasierten und polymetastasierten Erkrankungen assoziiert sind.

Und dieses Wissen zur Verbesserung der Früherkennung und Behandlung von Metastasen zu nutzen. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass wir doppelt markierte monoklonale Zelllinien verwenden, die von Patienten mit Darmkrebs stammen, und die Entwicklung von Lebermetastasen sowohl in vivo als auch ex vivo beobachten können. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf eine Therapie der metastasierten Erkrankung.

Es gibt uns die Möglichkeit, jedes potenzielle Medikament mit quantitativer Schätzung der Anzahl der metastasierenden Läsionen und der Wachstumskinetik jeder Läsion zu testen. Nach der Erzeugung von Luciferase-tdTomato-markierten HCT116-Zellen und der Vorbereitung von Medien, Reagenzien und Instrumenten gemäß dem Textprotokoll werden die transspectierten Zellen mit den folgenden Dichten pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung in 96-Well-Platten plattiert. Nach der fünfstündigen Inkubation der Zellen quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensitäten von tdTomato mit einem IVIS-System, indem Sie die Bildsoftware auf dem Desktop starten.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren, um die Imaging-Zeit, das mittlere Binning, zwei für Blende, 535 für den Anregungsfilter und 580 für den Emissionsfilter zu initialisieren. Setzen Sie die 96-Well-Platte auf die Imaging-Station und klicken Sie auf Erfassen, um die Bildgebung zu starten. Nachdem das Bild aufgenommen wurde, klicken Sie in der Werkzeugpalette auf ROI-Werkzeuge und wählen Sie 12x8 aus dem Schlitzsymbol aus.

Erstellen Sie 12x8-Schlitze, um den Bereich des Signals auf dem Bild der 96-Well-Platte abzudecken, und klicken Sie auf die Registerkarte Messungen. Betrachten Sie ein Fenster mit der Tabelle der ROI-Messungen in Einheiten von Photonen pro Sekunde, pro Steradiant, pro Quadratzentimeter. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 Prozent erreicht haben, etwa eine Stunde vor der Milzinjektion, fügen Sie den Zellen 0,05 Prozent Tripsin und 0,53 millimolare EDTA hinzu, um sie zu dissoziieren.

Nachdem Sie die Zellen drei bis fünf Minuten lang inkubiert haben, verwenden Sie ein gleiches Volumen C-DMEM, um das Tripsin zu neutralisieren. Pipettieren Sie die Kulturen gründlich, um ein Verklumpen zu vermeiden, und verwenden Sie dann einen automatischen Zellzähler, um die Zellen zu zählen. Frieren Sie suspendierte Zellen in 1x DBPS in einer Konzentration von 1,2 bis 2 x 10 auf die 6 Zellen pro 100 Mikroliter ein und pipettieren Sie gründlich, um ein Verklumpen zu vermeiden.

Halten Sie die Zellen dann bis zur Injektion auf Eis und suspendieren Sie sie gelegentlich wieder im Röhrchen. Nach der Verabreichung von Schmerzmitteln und der Anästhesie einer sechs bis acht Wochen alten weiblichen athymischen Nacktmaus gemäß dem Textprotokoll identifizieren Sie die Milz als einen violetten Bereich, der von außen durch die Haut an der linken Flanke zu sehen ist, und machen Sie einen acht Millimeter langen Schnitt an der linken Flanke auf der Haut direkt über dem Organ. Als nächstes hebst du die Bauchdecke an und machst einen kleinen Schnitt.

Lassen Sie Luft in die Bauchhöhle, so dass sich die inneren Organe von der Schnittstelle entfernen. Vergrößern Sie dann den Bauchwandschnitt auf etwa fünf Millimeter. Die für die Injektion gezeigten Schritte sind entscheidend für das Verfahren.

Das Austreten von Tumorzellen während der Injektion kann zu extrahepatischen Metastasen führen. Die Injektion sollte langsam über 30 bis 60 Sekunden mit nicht mehr als 1,5 Millionen Zellen erfolgen, um eine Pfortaderthrombose zu verhindern. Legen Sie die Milz frei, indem Sie mit einem Wattestäbchen vorsichtig Druck auf den Schnitt ausüben.

Bei Bedarf kann das Bauchspeicheldrüsenfett sanft manipuliert werden, um die Exposition zu erleichtern und die Milz nicht zu verletzen. Injizieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 27-Gauge-Nadel über einen Zeitraum von 30 bis 60 Sekunden 100 Mikroliter Zellen in die Spitze der freiliegenden Milz. Platzieren Sie am Ende der Injektion vor dem Entfernen der Nadel einen Mikroclip auf der Milz, um ein Auslaufen der injizierten Zellsuspension zu verhindern, und lassen Sie ihn fünf Minuten lang an Ort und Stelle.

Verwenden Sie fünf Minuten nach der Injektion ein tragbares Kautergerät, um eine Splenektomie zur Blutstillung durchzuführen. Beginnen Sie mit dem Milzhilum auf der vorderen Seite, indem Sie die proximale Seite der Gefäße mit angrenzendem Fettgewebe vorkoagulieren. Milzblutungen können an der Injektionsstelle auftreten.

Der Mikroclip wird an der Milz angebracht, um das Austreten von Tumorzellen zu verhindern und Milzblutungen zu kontrollieren. Methoden der Blutstillung können Kauterisation, Druckhaltung für drei bis fünf Minuten und bei Bedarf Nahtligatur umfassen. Verschließen Sie die Bauchdecke mit einer resorbierbaren 5.0 geflochtenen Naht und einem einzigen horizontalen Stich.

Verwenden Sie dann eine nicht resorbierbare Monofilamentnaht 4.0, um die Haut zu schließen, ebenfalls mit einem einzigen horizontalen Stich. Überwachen Sie das Tier postoperativ gemäß dem Textprotokoll. Um eine biolumineszierende Bildgebung durchzuführen, injizieren Sie den Tieren nach der Anästhesie von Mäusen gemäß dem Textprotokoll intraperitoneal 150 Mikroliter zuvor vorbereitetes Glühwürmchen-Luciferin.

Platzieren Sie die Mäuse in Rückenlage mit Abstandshaltern zwischen den Tieren, um das Signal an benachbarte Mäuse zu minimieren. Drei Minuten nach der Luciferin-Injektion, nach der Initialisierung des IVIS, wählen Sie Lumineszenz, eine Sekunde Belichtungszeit und mittleres Binning. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen, um die Bildgebung zu starten, und stellen Sie sicher, dass die Bildgebung drei Minuten nach der Luciferin-Injektion konsistent durchgeführt wird.

Nachdem das Bild aufgenommen wurde und ein Bildfenster und eine Werkzeugpalette angezeigt werden, klicken Sie auf ROI-Werkzeuge und wählen Sie im Kreissymbol eine Zahl zwischen eins und fünf aus, die der Anzahl der abgebildeten Mäuse entspricht. Um ROIs zu definieren, kreisen Sie den Signalbereich des Lumineszenzsignals in der Bauchhöhle der Maus ein, und klicken Sie dann auf Messungen des ROI als beliebige Einheit der Strahldichte. Fügen Sie einen zusätzlichen ROI-Kreis für den Hintergrund hinzu.

Vier Wochen nach der Injektion wählen Sie zur Durchführung einer diffusen lumineszierenden Bildgebungstomographie (DLIT) nach der Initialisierung des IVIS Bildgebungsassistent, Biolumineszenz und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie DLIT aus, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie Firefly-Sonden aus und klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie Maus für Bildmotiv, Auto für Belichtungsparameter, C-13 Zentimeter für Sichtfeld und 0,5 Zentimeter als Motivtyp und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Erfassen, um das Imaging zu starten. Nachdem Sie ein Bild erfasst haben, wählen Sie auf der Registerkarte Analysieren die Registerkarte DLIT 3D-Rekonstruktion aus und klicken Sie auf Rekonstruieren, um das 3D-Rekonstruktionsbild zu generieren.

Klicken Sie auf Werkzeuge und 3D-Animation. Wählen Sie dann im Fenster "3D-Animation" die Option "CCW auf Y-Achse drehen" aus. Klicken Sie auf Aufzeichnen und Speichern, um die Datei in einer Datei im MOV-Format zu speichern.

Um eine Ex-vivo-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen, messen Sie nach der Entnahme und Präparierung von Lebern von Mäusen gemäß dem Textprotokoll die Fluoreszenzintensitäten für jede Tumorkolonie mit dem IVIS. Durch Auswahl von Fluoreszenz, vier Sekunden Belichtungszeit, Medium Binning, 2 für Blende, 535 für den Anregungsfilter und 580 für den Emissionsfilter. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen, um das Imaging zu starten.

Nachdem Sie das Bild aufgenommen haben, suchen Sie das Bildfenster in der Werkzeugpalette. Klicken Sie auf ROI-Tools und wählen Sie 1 aus dem Kreissymbol aus. Um ROIs zu definieren, kreisen Sie den Signalbereich einzelner Tumorkolonien auf dem Bild ein.

Erfassen Sie einen zusätzlichen ROI-Kreis des Hintergrunds, und klicken Sie dann auf Messungen des ROI als beliebige Einheit der Strahlkraft. Erfassen Sie einen zusätzlichen ROI-Kreis des Hintergrunds. Führen Sie abschließend Berechnungen gemäß dem Textprotokoll durch.

Wie hier anhand der Biolumineszenz gezeigt wurde, wiesen die HCT116 L2T-Klone P1 und P2 drei Wochen nach der Milzinjektion eine größere Tumorlast auf, verglichen mit den Klonen O1 und O2. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Klone O1 und O2 oligometastasierende Erkrankungen nachahmen können, während P1 und P2 eine aggressive, weit verbreitete metastasierende Besiedlung der Leber darstellen. Die Quantifizierung der ex vivo-Fluoreszenz der Leber vier Wochen nach der Milzinjektion bestätigte, dass P1 und P2 im Vergleich zu O1- und O2-Lebern höhere Fluoreszenzintensitäten aufwiesen. Die Fluoreszenzmarkierung von Tumorklonen identifizierte die Anzahl und Größe einzelner metastasierender Kolonien in der Leber.

Insgesamt stimmten die ex vivo Fluoreszenzbilder mit den makroskopischen Befunden überein, aber kleine Kolonien, die unter der Oberfläche verborgen waren, konnten durch Fluoreszenzbildgebung besser erkannt werden. Wie hier dargestellt, wurden die Anzahl und Größe der metastasierenden Kolonien in jeder Leber gezählt und gemessen, und es wurde eine ex vivo Fluoreszenzbildgebung an jeder metastasierenden Kolonie für jeden Monoklon durchgeführt. Wie in diesen Diagrammen gezeigt, war die Gesamtzahl der Metastasen in P1 höher als in P2, O1 und O2, während die durchschnittliche Größe der einzelnen Kolonien in P2 größer war als in P1, O1 und O2. Unser Modell bietet einen Ansatz zur Identifizierung neuer Überzeugungsgene, die mit der molekularen Heterogenität der Metastasierung assoziiert sind.

Diese Gene können als Angriffspunkte für neue Ansätze zur Metastasenbehandlung genutzt werden. Unser Modell kann auch für die Validierung verschiedener proteinkodierender und nicht-kodierender Gene verwendet werden, die aus aktuellen großen klinischen Datenbanken stammen, aber noch nicht funktionell im Zusammenhang mit metastasierten Erkrankungen definiert sind. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Delikatesse der Tierchirurgie Schwierigkeiten haben.

Mit etwas Übung sind jedoch in kurzer Zeit gute Ergebnisse zu erzielen. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, die Richtlinien für Tierchirurgie zu befolgen, Blutungen sorgfältig zu kontrollieren und das Austreten von Tumorzellsuspension zu verhindern.