G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Lebendzell-Forster-Resonanz-Energietransfer- oder FRET-basierten Assays besteht darin, G-Protein-selektive G-Protein-gekoppelte Rezeptor- oder GPCR-Konformationen unter verschiedenen Agonistenbedingungen zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im GPCR-Bereich über GPCR-Wechselwirkungen mit verschiedenen Effektoren und die Wirkung verschiedener Medikamente auf die Rezeptorbestätigung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Sensoren modular aufgebaut sind und leicht für verschiedene GPCR- und G-alpha-Peptidkombinationen umgebaut werden können, einschließlich der vollständigen und der G-alpha-Untereinheit.

Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Auswahl von G-Proteinen und die Reaktion auf verschiedene Lygene geben. Es kann auch angewendet werden, um die physiologischen Folgen einer differentiellen G-Protein-Aktivierung zu untersuchen. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, kultivieren Sie die interessierenden Zellen in einem vollständigen Medium bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre bei fünf Prozent Kohlendioxid, bis die Kulturen Konfluenz erreichen.

Als nächstes lösen Sie die Zellen mit Trypsin ab und passieren die Kulturen bei acht mal 10 bis den fünften Zellen pro Zelle in zwei Millimeter Medium in eine mit sechs Vertiefungen behandelte Gewebekultur für sechzehn bis 20 Stunden Kultur. Nach 16 bis 20 Stunden wird eine Transfektionsreaktion pro Vertiefung vorbereitet, wenn die Zellen an den Platten in einer biologischen Sicherheitswerkbank haften, und die Reagenzienmischungen 15 bis 30 Minuten lang äquilibrieren lassen. Am Ende der Inkubation fügen Sie jeder Zellkultur eine Reaktion tropfenweise über die Vertiefung hinzu.

Schütteln Sie die Platte leicht, um eine gründliche Verteilung des Reagenzes in den Kulturen zu gewährleisten. Anschließend stellt man die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator. Analysieren Sie nach 20 Stunden die Kulturen auf die Proteinexpression der Plasmamembran und beurteilen Sie die Zellgesundheit.

Wenn eine signifikante Internalisierung des Proteins beobachtet wird, ist die Transfektion zu überwachen, bis eine signifikante Expression an der Plasmamembran nachgewiesen wird. Die Beurteilung des Proteinexpressionsniveaus ist für einen optimalen Versuchsaufbau unerlässlich. Wenn die Zellen schlecht transfiziert wurden oder die Proteinexpression zu gering ist, warten Sie mit der Ernte der Zellen.

Andernfalls kann das Fluoreszenzsignal für die Analyse ungeeignet sein. Wenn die Zellen erntereif sind, überführen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank und entfernen Sie vorsichtig einen Milliliter des Mediums. Mit einer P1000-Pipette resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter verbleibendem Medium pro Vertiefung und überführen Sie die Zellsuspensionen in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Zählen Sie die Zellen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie das Medium aus dem Zellpellet. Der Überstand wird vorsichtig in einem Milliliter 37 Grad Celsius heißem Zellpuffer resuspendiert und die Zentrifugation wiederholt.

Resuspendieren Sie das Pellet nach dem zweiten Spin in einer Konzentration von viermal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in frischem Zellpuffer. Geben Sie anschließend 90 Mikroliter Kontrollzellen in eine Küvette und erfassen Sie das FRET-Spektrum der Kontrolle. Nachdem Sie drei bis fünf Wiederholungskontrollspektren mit frischen 90 Mikrolitern Zellen für jede Messung gesammelt haben, wiederholen Sie die Suspensions-, Schleuder- und Waschschritte für transfizierte Zellen.

Aliquot 90 Mikroliter transfizierter Zellen auf jedes 500-Mikroliter-Röhrchen in den Haltern zwei bis sechs und acht bis 12 in einem Wärmeblock, wobei die Zellen zwischen jedem Aliquot sanft resuspendiert werden. Wenn alle Zellen übertragen wurden, geben Sie 10 Mikroliter Wirkstoffpuffer in die Röhrchen zwei bis sechs für die unbehandelten Proben der Erkrankung. Geben Sie dann 10 Mikroliter des einen Millimolar der Arzneimittellösung in die achte Tube.

Starten Sie einen Timer, um den Countdown von 10 Minuten zu starten, und verwenden Sie eine P200-Pipette, um den Inhalt des Röhrchens vorsichtig zu mischen. Verschließen Sie das Rohr nach dem Mischen und legen Sie es wieder in den Heizblock. Nehmen Sie dann sofort die zweite Röhre auf.

Mischen Sie den Inhalt vorsichtig mit einer neuen Spitze. Geben Sie 90 Mikroliter der transfizierten Zellsuspension in die unbehandelte Küvette und legen Sie die Küvette in das Fluorometer. Erfassen Sie das FRET-Spektrum für die Probe mit den gleichen Parametern wie für die Kontrollspektren.

Nach neun Minuten und 10 Sekunden wird das Spike-Röhrchen neun mit 10 Mikrolitern der einmillimolaren Arzneimittellösung gefüllt. Mischen Sie den Röhreninhalt vorsichtig und legen Sie die Röhre wieder in den Heizblock. Nehmen Sie dann sofort das dritte Röhrchen und mischen und messen Sie den Küvetteninhalt, wie gerade für das zweite Röhrchen gezeigt.

Mischen Sie das achte Röhrchen nach fünf Minuten und 10 Sekunden vorsichtig mit einer P200-Pipette. Geben Sie 90 Mikroliter der Zellsuspension in eine separate Küvette für die Messung der mit dem Arzneimittel behandelten Probe und erfassen Sie das FRET-Spektrum für die Probe des Arzneimittelzustands. Nachdem alle Spektren erfasst wurden, speichern Sie die Projektdateien.

Waschen Sie die Küvetten gründlich mit Reinstwasser und füllen Sie die Röhrchen für den nächsten Zustand auf. In diesem Bild ist eine homogene Zellkultur-Monoschicht zu sehen, die optimal für die Six-Well-Plattierung und Transfektion ist. Diese Zellen, die in verklumpten Mustern wachsen, die zu dendritischen Formen führen, werden jedoch nicht für eine konsistente Plattierung und genaue Proteinexpressionsanalyse oder FRET-Messung empfohlen.

Auch die Transfektionsbedingungen können optimiert werden, um eine reproduzierbare Expression zu erreichen. Sobald alle Daten gesammelt und zur Analyse in eine CSV-Datei eingegeben wurden, ähneln die generierten Ergebnisse diesen repräsentativen RAW- und normalisierten mittleren FRET-Spektren. Alle RAW-FRET-Spektren aus diesem repräsentativen Experiment zeigen einen glatten, ausreichenden Signal-Rausch-Bereich, der eine konsistente Datenanalyse mit einem minimalen Wasserpeak aus der Probe ermöglicht.

Wenn die Daten auf 475 Nanometer normiert werden, wird die Anzahl pro Sekunde dieses Wertes auf 1,0 gesetzt, und die signifikante Änderung beim 525-Nanometer-Messwert zwischen den behandelten und unbehandelten Proben wird deutlich. Wenn die Proteinexpression niedrig ist oder eine schlechte Transfektionseffizienz oder eine geringe Zelldichte in der Küvette für die Fluoreszenzmessung vorliegt, können die RAW-Daten verrauscht sein, was zu Problemen bei der Hintergrundsubtraktion und -normalisierung führt, was zu Spektren führt, die nicht ausgerichtet sind und nicht analysiert werden können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 25 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen in allen Schritten des Experiments vorsichtig zu behandeln. Nach diesem Verfahren kann die Technik erweitert werden, um verschiedene Rezeptor-FRET-Sensoren, verschiedene Medikamente und Effektoren sowie verschiedene Zelltypen zu testen. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik zum GPCR-Bereich beigetragen, wo neuere Studien mit diesen Sensoren Licht auf den molekularen Mechanismus der G-Protein-Selektion geworfen haben.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bestimmte GPCR-Bestätigungen mit einem FRET-Konstrukt-Messassay für lebende Zellen beurteilen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Säugetierzellkulturen und bestimmten experimentellen Medikamenten äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung getroffen werden sollten.