三维超F-微丝高分辨率显微镜通过干涉光敏定位显微镜（iPALM）

该程序的总体目标是使用称为 iPALM 的三维超分辨率显微镜方法，在超微结构水平上可视化贴壁哺乳动物细胞中的肌动蛋白细胞骨架。iPALM 成像在所有三个维度上提供次趋势纳米空间分辨率。这使得可以使用荧光探针可视化超微结构，从而实现高标记特异性。

本视频中介绍的程序应具有快速适应性和指导性，以便通过基于超分辨率显微镜的单分子定位来可视化细胞中的其他超微结构特征。通过在六孔板中制备盖玻片上的细胞来开始此过程。要组装成像样品，请使用细镊子轻轻地从缓冲液孔中取出样品盖玻片。

然后，用折叠的吸水纸接触盖玻片的边缘，快速、轻柔地敲掉多余的缓冲液。将盖玻片单元的一面朝上放在一张干净的镜头纸上。将 30 至 50 微升成像缓冲液滴到样品上冲洗样品。

通过倾斜并用折叠的吸水纸敲击来去除多余的缓冲液。重复冲洗步骤几次后，将 30 至 50 微升成像缓冲液滴到样品上。吸干盖玻片的边缘，并将多个非常小的快速固化环氧树脂点放在干燥区域。

慢慢地将另一个预先清洁的 1.5 号盖玻片降低到包含 22 毫米盖玻片的单元中心。让成像缓冲液通过毛细管作用润湿两个盖板玻璃。快速固化环氧树脂的小点应粘附在两个盖板玻璃上。

使用折叠的吸收纸轻轻按压组装好的样品，以均匀分布压力。使用足够的压力使样品池变薄且均匀，但不要压碎细胞。通过观察牛顿环模式来测量合适的厚度。

确保轻柔地执行此步骤，以尽量减少气泡。如果需要，请事先用空盖玻片练习几次。接下来，用熔化的凡士林羊毛脂石蜡密封样品。

然后用去离子水冲洗密封的样品。用压缩空气吹干样品，以准备安装到显微镜上。向上移动弹簧加载的顶部物镜，以便卸下样品架。

将密封的样品放在样品架上，并用几个小稀土磁铁固定。在成像样品的两侧涂抹浸油。将样品架放回光路中，然后轻轻降低顶部物镜。

打开激发激光器。同时在帧传输模式下打开 EMCCD 相机。接下来，旋转适当的发射滤光片。

激活机械快门以阻挡顶部光束路径并打开底部光束路径。使用压电促动器以小增量平移，使底部物镜聚焦。一旦基准点聚焦，打开顶部光束路径，同时阻挡底部光束路径，并以类似的方式使顶部物镜聚焦。

在计算机显示屏上监控基准的宽度以实现最佳对焦。为了正确定位，请打开顶部和底部光束路径。使用一对超细固定螺钉手动调整顶部物镜，同时保持底部物镜不变，直到基准图像尽可能紧密地重叠，最好在一个像素内。

随后，执行微调，使基准图像重叠在 EMCCD 像素的十分之一以内。通过控制软件调整顶部双轴压电镜，同时保持物镜和底部反射镜不变。通过计算机显示器比较顶部和底部客观视图的基准中心，以指导该过程。

在激光器打开的情况下，相机连续流动，顶部和底部光束路径都打开，使用控制软件生成的正弦电压波形振荡样品架 Z 压电陶瓷，从而在 400 纳米幅度上连续 Z 轴振荡。手动向上或向下平移电动分束器组件，直到基准点的强度振荡。由于所需的单光子干涉效应，这意味着光程长度的紧密匹配。

在最佳情况下，可以实现大于 10 的峰谷比。为了确保每个表面的振幅和相位在整个磁场中尽可能均匀，请以小步长调整分束器组件的底镜，以微调间隙和倾斜角度。通过在 800 纳米上以 8 纳米 Z 步长平移样品来执行分束器精细对准。

监控 1 到 3 摄像机之间的基准强度。以小步长调整分束器组件内底镜的高度、位置和倾斜度，使相机 1 相对于相机 2 的振荡相位最大化，理想情况下为 120 度。初始对齐完成后，平移样品以扫描合适的视野，该视野包含细胞到图像和附近的多个基准点。

系统周围放置一个外壳以阻挡杂散光和环境干扰。找到成像区域后，再次平移样品并记录校准曲线以用于后续的 Z 坐标提取。在主界面中使用命令 acquire calibration scans versus sample piezo position。

找到所需区域并获得校准曲线后，在软件中输入适当的文件名。打开顶部和底部光束路径，然后将 642 纳米激光器的激发功率增加到最大。对于 Alexa Fluor 647，可能需要 Fluor-4 关闭的初始时间。

以恒定的 642 纳米激发曝光 5 分钟，必要时可延长曝光时间，直到观察到单个分子闪烁。该软件允许在采集过程中自动增加 405 纳米的光活化。通常需要大量的采集帧才能清晰可见丝状特征。

准备就绪后，使用主界面中的命令 start iPALM acquisition 开始采集原始图像集。在采集过程中，通过调整 405 纳米激光的强度来调整光活化水平，以根据需要保持适当的闪烁密度。当样品盖玻片正确组装时，在环境光或标准荧光灯下可以用肉眼观察到牛顿环。

提取荧光发射器的轴向位置需要在 iPALM 成像中同时进行多相干涉，其由三个 EMCCD 中给定基准的强度变化进行校准。然后将强度归一化并拟合以确定相位差。这是重建的 iPALM 图像，每个定位坐标都由 2D 高斯渲染，宽度对应于定位不确定性。

Z 坐标根据颜色条进行着色。可以看到密集和稀疏的丝状特征区域。此处显示的是 Alexa Fluor 647 鬼笔环肽标记的 HUVEC 细胞肌动蛋白细胞骨架的重建 iPALM 图像。

图像颜色根据颜色条指示 Z 坐标。横向横截面直方图由沿方框区域长轴的 XY 定位坐标生成。高斯拟合显示与横向横截面相关的半峰全宽为 43.88 纳米。

此直方图是方框区域中定位坐标的 Z 位置。高斯拟合显示半峰为 17.50 纳米的全宽。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 90 分钟内完成。

看完这段视频后，您应该了解了如何使用 iPALM 通过简单的准备和安装、光学对准、原始数据采集以及随后的分析来可视化超微结构中的肌动蛋白细胞骨架以重建超分辨率图像。该技术发展后，为细胞生物学领域的研究铺平了道路，以探索肌动蛋白细胞骨架的纳米级结构，以及黏着斑等细胞粘附结构。