포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

이 절차의 전반적인 목표는 유방암 간 전이의 실험적 모델링을 위해 종양 세포를 쥐 간에 직접 전달하는 것입니다. 이 방법은 쥐 간에서 전이성 연쇄 반응의 후기 단계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 유방암 세포 유출, 파종, 사멸, 증식, 휴면 결정, 파생물 등이 포함됩니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 비장을 제거하거나 수반되는 다기관 전이 없이 종양 세포를 간으로 직접 전달한다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 문맥 주입이 직접적인 해부학적 감시에 의존하는 정밀한 조작이 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 이 절차를 도와줄 사람은 Pepershadine 연구실의 대학원생인 Alexandra Quackenbush입니다.

시술을 시작하기 전에 수술 부위의 모든 표면을 10% 표백제로 닦아내십시오. 주사 1시간 전에 8-15주 된 balb/c 암컷 쥐를 100마이크로리터의 진통제로 치료하여 통증 관리를 위해 피하로 합니다. 동물의 눈에 연고를 바르십시오.

그런 다음 마우스를 누운 자세로 놓고 발가락 꼬집기로 적절한 수준의 진정 효과를 확인합니다. 다음으로, 멸균 거즈에 적신 2% 클로르헥시딘 물티슈 3개와 알코올 준비 패드 물티슈 2개를 번갈아 가며 꼬리를 포함한 동물의 수술 부위와 주변 부위를 소독합니다. 클로르헥시딘을 마지막으로 닦은 후, 멸균 메스를 사용하여 마우스의 왼쪽에 있는 정중면과 시상면 사이의 피부를 갈비뼈 바로 아래에서 시작하여 네 번째 서혜부 유선 젖꼭지 위에서 끝까지 1인치 절개한 다음 복막을 통해 유사한 1인치 절개를 합니다.

이제 종양 세포를 위아래로 여러 번 피펫팅하여 세포 용액을 다시 현탁시키고 32 게이지 바늘이 장착된 25 마이크로리터 탈착식 바늘 주사기에 10 마이크로리터의 세포를 로드합니다. 세포가 바늘 끝에 있고 플런저가 주입하기에 적절한 부피가 될 때까지 플런저를 누릅니다. 주입된 바늘의 외부를 멸균 알코올 패드로 닦아 외부 종양 세포를 제거하고 바늘이 찔리지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 절개 부위의 중앙쪽 피부와 복막 내벽을 겸자로 잡고 멸균 면봉을 사용하여 멸균 식염수에 적신 멸균 거즈에 대장과 소장을 조심스럽게 움직입니다. 내부 장기를 식염수에 적신 거즈로 덮어 내부 수분과 무균 상태를 유지합니다. 문맥이 보이면 조수가 장을 부드럽게 잡고 멸균 면봉으로 문맥을 노출시키고 간 아래 약 10mm의 문맥에 5도 미만의 각도로 비스듬한 면이 위로 향하게 바늘을 삽입하도록 합니다.

종양 세포를 가득 채우고 종양 세포가 정맥 밖으로 역류하는 것을 방지하기 위해 몇 초 동안 혈액이 바늘 머리를 지나 흐르도록 천천히 주입합니다. 문맥에 대한 적절한 시각화, 접근 및 주입이 필수적이므로 주입을 시도하기 전에 바늘과 관련하여 문맥의 위치가 만족스러운지 확인하는 시간을 가지십시오. 모든 세포가 주입되면 바늘을 제거하는 동시에 멸균 면봉 어플리케이터로 정맥에 부드러운 압력을 가합니다.

그런 다음 새 멸균 면봉 어플리케이터를 사용하여 0.5-1cm 정사각형의 지혈 거즈를 주사 부위에 고정합니다. 5분 후 거즈를 조심스럽게 들어 올려 정맥 폐쇄를 평가합니다. 혈류가 완전히 멈추면 거즈를 제거하고 장을 복강으로 되돌립니다.

단순 연속 또는 단속 봉합 패턴을 사용하여 멸균 4개의 제로 비크릴 봉합사 및 테이퍼로 복막 내벽을 닫습니다. 같은 방법으로 피부를 봉합한 후 절개 부위를 따라 100마이크로리터의 국소 마취제를 주입한 후 0.5ml의 멸균 식염수를 피하로 전달합니다. 문맥의 정확한 해부학적 식별과 성공적인 문맥 내 주입은 인도 잉크 또는 이와 유사한 염료로 주입 프로토콜을 연습하여 확인할 수 있습니다.

문맥을 통해 올바르게 주입하면 잉크가 폐로 퍼지지 않고 즉각적이고 특이적으로 간으로 전달됩니다. GFP로 표기된 쥐 기억 종양 세포를 사용하여 주입 후 90분에 간 전체의 종양 세포 분산이 명백하여 간으로의 성공적인 문맥 전달을 확인합니다. 종양 세포는 정맥 혈액이 간으로 들어가는 문맥 삼합체와 매우 가까운 간 실질 내에서뿐만 아니라 정현파 내에서 발견되며, 이는 현재 활성 종양 세포 유출이 일어나고 있음을 시사합니다.

이러한 생존 곡선에서 입증된 바와 같이, 공격적인 유방 종양 세포주의 입양 문맥 이식은 덜 공격적인 종양 세포주를 주입한 마우스에 비해 전이가 없는 생존율이 더 짧습니다. 이 동물의 전이는 250미크론 수준에서 간을 절편하고 샘플의 후속 H&E 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 또한, 면역형광 분석은 이러한 대표적인 이미지에서 입증된 바와 같이 CD45 음성, Heppar-1 음성 및 CK18 양성인 D2A1 종양주와 같은 태그가 지정되지 않은 syngenic 라인의 미시 및 거시 전이성 병변 분석에 유용합니다.

이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 마우스당 12-14분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 주입을 시도하기 전에 문맥을 적절하게 시각화하고 액세스하는 데 필요한 시간을 할애하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 종양 세포 주입 후 생체 내 이미징과 같은 다른 방법을 수행하여 종양 세포가 lubramicro 환경과 어떻게 상호 작용하는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 기술의 개발을 통해 전이 분야의 연구자들은 생쥐에서 다양한 암의 전이성 연쇄 반응의 후기 단계를 탐구할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 외과적 절개 위치, 문맥에 접근하기 위해 내부 장기를 부드럽게 움직이는 방법, 문맥 내 주사를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 종양 세포가 들어 있는 주사기로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 주사 바늘이 찔리지 않도록 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.