サイレージのメタゲノム解析

この実験の全体的な目標は、サイレージサンプル内に存在する細菌群集を理解することですが、これらの手順はさまざまなサンプルタイプに適用できます。この方法は、ここで紹介した動物飼料用サイレージのように、複雑な微生物システム内に見られる原核生物群集を特定する際の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、従来の16Sアンプリコンシーケンシングではなくショットガンシーケンシングが採用されているため、マイクロバイオームの分類精度が大幅に向上していることです。

この方法は、人間の腸内、皮膚の表面、水サンプル、さらにはオフィスのコーヒーマシンの周囲など、複雑な小宇宙が形成される可能性のある他のさまざまなサンプルに適用できます。市販のキットを使用して、サイレージサンプルからDNAを抽出します。この手順は、付属の溶解チューブ内の978マイクロリットルのリン酸ナトリウム緩衝液と122マイクロリットルの土壌溶解緩衝液に100〜400ミリグラムのサンプルを追加することから開始します。

サイレージサンプルがないネガティブコントロールを含めます。溶解チューブをホモジナイザーに40秒間、秒速6.0メートルの速度で入れて、サンプルを均質化します。ライセートを15分間遠心分離します。

上清を250マイクロリットルのタンパク質沈殿液が入った清潔な微量遠心チューブに移し、溶液を10回反転させて混合します。その後、5分間遠心分離します。上清を、1ミリリットルのDNA結合マトリックスを含む清潔な15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

チューブを3分間絶えず反転させて溶液を混合します。混合物を3分間沈殿させてから、500マイクロリットルの上清を廃棄し、残りの上清をピペッティングで混合します。懸濁液の600マイクロリットルをスピンフィルターに移し、1分間Gの14, 000倍で遠心分離します。

濾液を廃棄し、残りの懸濁液でプロセスを繰り返します。濾液を廃棄した後、スピンフィルター内のDNA結合マトリックスに500マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、ピペッティングで混合し、1分間Gの14,000倍で遠心分離します。濾液を廃棄し、スピンフィルターを2分間遠心分離して、すべての洗浄バッファーが除去されていることを確認します。

スピンフィルターを摂氏23度で5分間乾燥させます。予め加温したDNaseフリーの水100マイクロリットルをDNA結合マトリックスに加え、スピンフィルターをきれいな1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。14, 000倍Gで1分間遠心分離し、DNAを溶出します。

さらなる分析で必要になるまで、DNAをマイナス20°Cで保存します。サイレージサンプルから抽出したDNAは、DNA精製ビーズを使用して精製されます。ビーズを冷蔵庫から取り出し、使用の少なくとも30分前に摂氏23度に置いておきます。

各DNAサンプルに2容量のビーズを加え、溶液を摂氏23度で5分間インキュベートします。サンプルを分離磁石に5分間置いた後、上清を捨てます。ビーズを200マイクロリットルの新鮮な80%エタノールで2回洗います。

ビーズを10分間風乾しますビーズは十分に乾燥させる必要がありますが、過度に乾燥させないようにするため、続行する前にビーズを目視で検査することが重要です。分離磁石からサンプルを取り出し、50マイクロリットルの溶出バッファーを加え、ピペッティングで混合します。懸濁液を摂氏23度で5分間インキュベートし、次にサンプルを分離磁石に3分間戻します。

DNAを含む上清をきれいなチューブに移し、ビーズを捨てます。この手順を開始するには、バッファーと試薬の比率が199対1の作業溶液を調製します。各DNA標準液10マイクロリットルを190マイクロリットルの作業溶液に加えます。

10マイクロリットルの精製DNAを190マイクロリットルの作業溶液に加えます。標準試料とDNAサンプルを摂氏23度で2分間インキュベートします。その後、画面の指示に従って蛍光光度計でDNAサンプルを採取する前に、標準試料を分析します。

精製されたDNAは高品質で正確に定量されていることが不可欠であるため、DNAの品質と濃度に疑問がある場合は、DNA抽出を繰り返す必要があります。ショットガンシーケンシングライブラリは、市販のライブラリ調製キットを使用して調製されます。溶出バッファーを使用して、DNAサンプルを1マイクロリットルあたり0.2ナノグラムに希釈します。

精製したDNAの5マイクロリットルを、10マイクロリットルのタグメンテーションバッファーおよび5マイクロリットルのタグメンテーション酵素ミックスと混合します。サンプルを摂氏55度で5分間インキュベートします。各サンプルに5マイクロリットルの中和バッファーを加え、溶液を摂氏23度で5分間インキュベートします。

次に、各サンプル特異的シーケンシングインデックスの5マイクロリットルとPCRマスターミックスの15マイクロリットルを追加します。サンプルをサーモサイクラーに入れ、PCRを行います。調製したDNAを、前に示したビーズ精製法を用いて精製しますが、最終的には30マイクロリットルの溶出バッファー

その後、DNAの配列決定を行い、テキストプロトコルに記載されているように、さまざまなバイオインフォマティクスツールを使用して配列データを分析します。細菌マイクロバイオームの分類学的分類は、Krackenソフトウェアで行い、次にCHROMAソフトウェアで視覚化しました。サイレージメタゲノムに存在する細菌種の大部分は、4つの原核生物フィラ内に見られ、フィルミキューテスは34%、アクチノバクテリアは28%、プロテオバクテリアは27%、バクロンティスは7%で、これらのフィラ内に存在するクラスの分布も示されています。

アセンブルされたリードに対して行われた機能アノテーションにより、推定炭水化物活性酵素として注釈が付けられた6,357の予測タンパク質と、炭水化物活性酵素データベースを構成する5つの酵素クラスのうちの1つが得られました。このベン図は、複数の酵素クラスアノテーションを含むタンパク質アノテーションの分布を示しています。これらのうち、3,591は配糖体加水分解酵素活性を有すると予測されました。

一度習得すれば、DNAシーケンシングライブラリーの調製は、適切に行えば1日で完了することができます。この手順を試行する際には、サンプル間に交差汚染がないことを確認し、ブランクなどの適切なコントロールを常に使用することが重要です。この手順に続いて、Krackenによって行われた分類を検証するために、他のバイオフォマティック分析を実行することができます。

これらのメタゲノム技術により、研究者は多くの複雑なシステムにおけるマイクロバイオームを探索することができます。このビデオを見れば、メタゲノムDNAシーケンシングライブラリの調製方法と、得られたDNA配列リードに対するバイオインフォマティクス解析の実施方法について十分に理解できるはずです。DNA結合試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には手袋や白衣などの予防措置を常に着用する必要があることを忘れないでください。