Name: 生产和治疗间充质干行政/基质细胞（MSC）球体底漆在三维培养下无异物条件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学习在无异物条件下制备间充质干细胞球体的方法，用于再生医学和细胞治疗研究。该技术可提高细胞存活率和功能，为临床应用提供更安全有效的方案。

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本工作部分由美国国立卫生研究院资助项目 P40RR17447 以及德克萨斯州癌症预防与研究所资助项目 RP150637 支持。我们感谢 Darwin J. Prockop 博士对本项目的支持。

1. 间充质干细胞的分离与扩增
<ol>
	<li>从成人干细胞制备与分发中心（<a href="http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html" target="_blank">http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html</a>）获取早期传代的间充质干细胞（MSCs），以冻存管形式保存15。或者，也可按照常规方案从骨髓穿刺液中分离MSCs14，并以冻存管形式储存。</li>
	<li>配制完全培养基（CCM），即在最低必需培养基α（αMEM）中添加15-20%优质选择胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素-链霉素。通过过滤除菌处理培养基。</li>
	<li>将30 ml CCM加入150 mm细胞培养皿中，置于含5% CO2的湿润化培养箱内，37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>将含有约106个MSCs的冻存管在37 °C水浴中孵育2分钟。</li>
	<li>使用5 ml移液管将冻存管内容物转移至培养皿中，并用培养皿中的1-2 ml CCM反复冲洗冻存管数次，以回收残留细胞。将培养皿置于适宜培养箱中过夜培养。</li>
	<li>用室温磷酸盐缓冲液（PBS）小心洗涤细胞两次，随后加入3 ml预热的0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液使MSCs脱落。通常在培养箱中孵育3-4分钟即可完成消化。</li>
	<li>用6 ml预热至37 °C的CCM中和培养皿中的胰蛋白酶，将细胞悬液转移至50 ml锥形管中。合并PBS洗涤液以最大化回收细胞。</li>
	<li>室温下以450 × g离心10分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用少量CCM重悬细胞沉淀，使用血细胞计数板和台盼蓝染色法计数活细胞数量。</li>
	<li>按100个细胞/cm2的密度，在30 ml温热的CCM中接种适量数量的150 mm培养皿，培养至细胞融合度达约70-80%，通常需7天，期间每2-3天更换一次培养基，并在收获前24-48小时进行最后一次换液。</li>
	<li>如上所述使用胰蛋白酶/EDTA消化收获细胞，将所有细胞合并至一个锥形管中，并加入适当培养基。再次离心后，用相同培养基少量重悬细胞用于细胞计数。可使用标准CCM（含FBS）或多种市售无动物源成分（XF）培养基配方，本文中分别称为XF medium-1（XFM-1）和XF medium-2（XFM-2），两者均设置添加或不添加人血清白蛋白（HSA，13 mg/ml）的条件。</li>
</ol>
2. 在XF条件下通过三维悬滴培养法制备活化MSC球体
<ol>
	<li>为生成约25,000个细胞的球体，将收获的MSCs稀释于CCM、XFM-1、XFM-1 + HSA（13 mg/ml）、XFM-2或XFM-2 + HSA（13 mg/ml）中，细胞浓度为714个细胞/µl。</li>
	<li>用移液器将35 µl/滴的细胞悬液滴加至150 mm倒置培养皿盖的底部。可使用多通道移液器轻松完成多个液滴的加样。 
	注意：若需制备更大或更小的球体，可相应调整细胞浓度或液滴体积（25–45 µl）。</li>
	<li>向培养皿底部加入20 ml室温PBS，然后连续而稳定地将含有液滴的皿盖翻转，使液滴尖端朝下。小心将皿盖放置于培养皿底部。</li>
	<li>将培养皿放入培养箱中静置培养3天，避免扰动，以促进球体的适当组装。</li>
	<li>72小时后，开始收获球体：小心取下皿盖并再次翻转，使液滴重新朝上。</li>
	<li>将皿盖倾斜约10–20°，使用细胞刮将含有球体的液滴推至培养皿边缘。</li>
	<li>用1,000 µl移液器将球体及培养基转移至15 ml锥形管中。使用室温PBS并用同一枪头进行冲洗，以确保最大限度回收球体。</li>
	<li>对于实时PCR检测（方案3），将球体悬液在室温下以450 × g离心5分钟，吸除上清液。用PBS洗涤球体，并重复离心和吸除步骤。对于向动物体内递送（方案8），无需离心，让球体在管底自然沉降（约3–4分钟）即可。</li>
</ol>
3. 抗炎和抗癌标志物的实时 PCR 检测
<ol>
	<li>使用配备匀浆柱和无RNase DNase试剂盒的RNA提取试剂盒，从经PBS洗涤并离心的单层MSCs（方案1）和MSC球体（方案2）中分离无DNA的总RNA。</li>
	<li>在含有β-巯基乙醇（1:100）的RLT缓冲液中，分别于15 ml圆底离心管中裂解至少100,000个单层MSCs和每种条件下20个球体。</li>
	<li>将充分混匀的裂解液转移至1.5 ml无RNase的离心管中，放入冷冻机（-80 °C）冷冻至少3小时，以促进球体的完全裂解。</li>
	<li>将细胞裂解液置于冰上解冻，短暂涡旋振荡，然后按照商品化哺乳动物总RNA提取试剂盒的制造商说明书进行RNA提取操作。</li>
	<li>使用分光光度计对提取的RNA进行定量并评估其质量。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用High Capacity cDNA逆转录试剂盒或同等产品，合成用于实时PCR的cDNA。</li>
	<li>将cDNA样品、商业化设计的实时PCR引物/探针（基因表达检测），以及PCR预混液置于冰上。所用引物/探针包括GAPDH（内参）、PTGS2（COX-2，抗炎）、TNFAIP6（TSG6，抗炎）、TRAIL（抗肿瘤）和IL-24（抗肿瘤）。</li>
	<li>根据Gene Expression Assays和Fast Universal Master Mix的制造商说明书，配制实时PCR反应体系。</li>
	<li>按照实时PCR仪器的操作指南创建实验文档并运行程序。</li>
	<li>采用ΔΔCT法分析数据，以GAPDH为内参基因，单层MSCs为基准样本，计算各基因表达的相对变化（相对定量，RQ）8,14。</li>
</ol>
4. 免疫调节和抗癌潜力检测用条件培养基的收集
<ol>
	<li>使用细胞刮和移液器，按照上述方法将类球体和条件培养基（CM）收集至15 ml锥形管中，但不要用PBS冲洗培养皿盖，以免稀释CM。</li>
	<li>在室温下以450 × g离心5分钟，小心地用移液器收集无细胞的上清液，并将上清液转移至1.5 ml离心管中。</li>
	<li>在室温下以10,000 × g离心5–10分钟，小心地用移液器收集澄清的CM，并将CM转移至新的1.5 ml离心管中，于-80 °C冰箱中保存。若需在多个检测中使用CM，建议在冷冻前预先分装。 
	注意：在进行下游检测之前，可使用商用ELISA试剂盒按照制造商说明书检测PGE2浓度，该指标可良好反映CM的抗炎潜力。TSG6浓度可依据已发表的实验方案14进行测定。</li>
</ol>
5. 评估间充质干细胞条件培养基抗炎潜力的巨噬细胞实验
<ol>
	<li>制备巨噬细胞培养基，该培养基由含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）组成，并添加10%优质选择胎牛血清（FBS）和1×青霉素-链霉素。对培养基进行过滤除菌。</li>
	<li>取一支含有约106个J774小鼠巨噬细胞的冻存管，将其在37 °C水浴中孵育2分钟。</li>
	<li>将冻存管内容物转移至15 ml锥形管中，加入9 ml巨噬细胞培养基，于室温下以200–300 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将巨噬细胞重悬于1 ml巨噬细胞培养基中，然后转移至含有30 ml巨噬细胞培养基的150 mm培养皿中。</li>
	<li>每2天更换一次培养基，并将细胞在培养箱中孵育至约70–80%汇合度。 
	注意：巨噬细胞在培养皿上的贴附性较弱，因此换液时应小心操作，避免细胞丢失。</li>
	<li>通过移液器将巨噬细胞培养基喷洒到细胞表面以收获细胞。将细胞转移至50 ml锥形管中，于室温下以200–300 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用少量巨噬细胞培养基重悬细胞，并用血细胞计数板进行细胞计数。用巨噬细胞培养基将细胞浓度调整至200,000个细胞/ml。</li>
	<li>开始巨噬细胞实验时，向12孔板的各孔中加入480 µl巨噬细胞培养基。</li>
	<li>向未刺激对照孔中加入20 µl巨噬细胞培养基，向实验孔中加入20 µl上述制备的非条件培养基或MSC条件培养基。通过轻敲培养板使孔内液体混匀。</li>
	<li>将500 µl巨噬细胞悬液转移至未刺激的巨噬细胞对照孔中。</li>
	<li>向其余巨噬细胞中加入0.1 mg/ml脂多糖（LPS）稀释液（稀释比例为1:500–1:1,000），室温孵育5–10分钟以进行刺激。</li>
	<li>将500 µl刺激后的巨噬细胞转移至含有非条件培养基或MSC条件培养基的孔中。通过反复轻柔摇动培养板数次使孔内液体混匀。</li>
	<li>将培养板转移至培养箱中孵育16–18小时。</li>
	<li>收集巨噬细胞条件培养基，在室温下以500 × g离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新管中，按照生产商说明书使用商用ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-10（IL-10）的含量。</li>
</ol>
6. 评估类球体条件培养基免疫调节潜力的脾细胞检测
<ol>
	<li>配制完全脾细胞培养基，该培养基由添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）、1×青霉素-链霉素和2-巯基乙醇的RPMI-1640（Rosewell Park Memorial Institute-1640）培养基组成。对培养基进行过滤除菌。</li>
	<li>通过在腹部左侧脾脏位置（前肢与后肢之间约中点处）做切口，从安乐死的雄性BALB/c小鼠中取出脾脏14。将脾脏转移至70 µm细胞筛网，以分离脾细胞14。</li>
	<li>使用2–3 ml注射器推杆的柔软橡胶/塑料端，在无菌培养皿上方将脾脏组织压过70 µm筛网，以分离脾细胞/淋巴细胞14。采用研磨式环形动作使脾脏组织充分解离。</li>
	<li>用冷的PBS多次冲洗细胞筛网，并将细胞从培养皿转移至50 ml锥形管中。用冷PBS充满管子，在4 °C下以500 × g离心10分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并加入5–10 ml红细胞裂解液（每只脾脏），孵育5–10分钟，以去除红细胞。</li>
	<li>通过向管中加入冷PBS终止裂解反应，在4 °C下以500 × g离心5–10分钟。</li>
	<li>将分离的细胞重悬于完全脾细胞培养基中，经40 µm筛网过滤后，使用血细胞计数板计数细胞。向细胞悬液中加入脾细胞培养基，调整细胞终浓度为106 个细胞/ml 
	注意：该方法通常每只小鼠脾脏可获得约3 × 107 个脾细胞。</li>
	<li>用2 µg/ml抗CD3e抗体刺激适量脾细胞，孵育5分钟。 
	注意：所需脾细胞数量取决于实验条件的数量，由研究者确定（见步骤6.9）。每个实验样本/孔需要106 个脾细胞。</li>
	<li>将106 个脾细胞（已刺激或未刺激）转移至12孔板的各孔中，并向孔中加入未处理的培养基（对照组）或MSC条件培养基（MSC-CM），终稀释比例为1:10至1:20。</li>
	<li>24小时后收集脾细胞条件培养基，在室温下以500 × g离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新管中，按照试剂盒说明书使用商用ELISA试剂盒检测干扰素γ（IFN-γ）含量。</li>
</ol>
7. 前列腺癌检测：评估球形体条件培养基抗肿瘤潜力的实验方法
<ol>
	<li>配制完全 RPMI 培养基，即在 RPMI-1640 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1× 青霉素-链霉素。</li>
	<li>取一管冻存的 LNCaP 前列腺癌细胞，将其置于 37 °C 水浴中孵育 2 分钟。</li>
	<li>使用电动移液器和 5 ml 血清移液管，将冻存管中的内容物转移至含有 30 ml 完全 RPMI 培养基的培养皿中。用培养皿中的培养基多次冲洗冻存管，并将培养皿放入培养箱中。</li>
	<li>在细胞即将达到汇合状态前，用室温的 PBS 洗涤细胞两次，并加入 3 ml 预热的 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液使 LNCaP 细胞脱落。</li>
	<li>用完全 RPMI 培养基中和培养皿中的胰蛋白酶，将细胞连同洗涤液一起转移至 50 ml 锥形管中。</li>
	<li>在室温下以 450 × g 离心 10 分钟，随后吸除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于少量完全 RPMI 培养基中，并使用血细胞计数板对癌细胞进行计数。</li>
	<li>将 LNCaP 细胞以每孔 5,000 个细胞接种于 96 孔板中，每孔体积为 120 µl，含 25% 未条件化培养基或类球体条件培养基（spheroid-CM）。在培养箱中孵育 72 小时。</li>
	<li>使用细胞增殖检测试剂盒进行细胞生长检测时，吸除各孔中的培养基，并将培养板置于冷冻机（-80 °C）中至少 3 小时。
	<ol>
		<li>将培养板解冻，并通过向每孔加入含 180 mM NaCl、1 mM EDTA 和 0.2 mg/ml RNase A 的 100 µl 细胞裂解试剂来裂解细胞。</li>
		<li>为建立标准曲线，按照上述方法裂解已知数量的 LNCaP 细胞。</li>
		<li>1 小时后，向每孔加入 100 µl 含有 1:100 稀释的细胞增殖检测试剂的 1× 细胞裂解缓冲液，并测定各孔的荧光强度以确定细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 完整类球体的腹腔递送
<ol>
	<li>按照上述方法（方案2）制备球状间充质干细胞（MSCs），并将球体重悬于添加了0.2–0.5%人血清白蛋白（HSA）的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，以维持XF条件。溶液中的HSA有助于防止球体在注射过程中黏附于塑料表面。</li>
	<li>将40–120个球状体转移至15 ml锥形管中，加入6 ml HBSS/HSA洗涤细胞。静置3–4分钟使球体沉降。为每只动物单独准备一个锥形管装球状体。如需，另准备额外的球状体管用于检测移植后球体的滞留情况（见下文8.18）及治疗因子的产生情况（见下文8.19）。</li>
	<li>吸除上清液，向球状体中加入100–200 µl添加了0.2–0.5% HSA的无菌HBSS，将管子置于冰上。</li>
	<li>使用100%氧气中含2%异氟烷的气体短暂麻醉动物，直至夹趾反射消失，约2分钟，在诱导室中完成。</li>
	<li>将动物置于BSL-2生物安全柜内，背部朝下（腹面朝上），通过鼻罩持续给予1.5%异氟烷/氧气混合气体。</li>
	<li>使用70%酒精等消毒剂清洁小鼠下腹部。</li>
	<li>取下20 G静脉（iv）导管的保护帽，使用导管-针芯组件进行腹腔注射。一手固定小鼠皮肤，另一手执行注射操作。注射点位于连接屈曲膝关节与生殖区域的人工连线中点附近，针尖朝向中线。 
	注意：导管-针芯组件的阻力高于普通针头，因此需小心操作，避免将针插入腹腔过深，以防损伤内脏器官。在置入导管时可感受到皮肤、肌肉及腹膜的穿透感。</li>
	<li>轻柔地将金属针芯/针头从导管-针芯组件中抽出。检查针芯上是否有血液、尿液或粪便，如有则丢弃。针头上出现血液提示可能刺破了内脏器官。</li>
	<li>注射过程中保持塑料导管垂直向上，以利于液体流动。</li>
	<li>使用带100–200 µl吸头的移液器，通过导管注入约100 µl无菌HBSS/HSA，以确认导管位置正确。将移液器吸头末端插入导管注射器接头内，形成紧密密封，缓慢将液体注入腹腔。 
	注意：若导管位置正确，液体应能自由流入腹腔，仅需轻微调整导管即可。若导管位置不当（如皮下、肠内，或针尖损伤腹膜器官如肾脏），则阻力增加，流速减慢。皮下置管会导致皮肤下形成明显的&#34;气泡&#34;。</li>
	<li>使用200 µl移液器吸头吸取步骤8.3中制备于100–200 µl HBSS/HSA中的MSC球状体，将全部体积（40–120个球体）通过上述导管注入腹腔。</li>
	<li>使用同一吸头，以100 µl HBSS/HSA冲洗装有球状体的管子，收集残留球体并注入腹腔。</li>
	<li>（可选）向腹腔内额外注入100 µl HBSS/HSA，以冲洗导管。</li>
	<li>将浸有消毒剂的纱布垫覆盖在导管上，缓慢将导管从腹腔中拔出并丢弃。</li>
	<li>用手轻轻按摩腹腔，确保球状体均匀分布。</li>
	<li>让动物在密切监护下恢复，并观察注射部位是否出血。</li>
	<li>检查导管和15 ml管中是否残留球状体。导管或管内发现少量球体属正常现象。 
	注意：上述MSC球状体递送技术可用于正常动物或多种损伤模型。该技术已成功应用于小鼠角膜损伤和内毒素血症模型，以及酵母聚糖诱导的腹膜炎模型8。</li>
	<li>为定量滞留的球状体数量（可选），可使用基于DNA的细胞计数试剂盒/试剂。将使用过的导管置于15 ml管上方，用力通过导管吹打HBSS/HSA，迫使残留球体返回15 ml管中。
	<ol>
		<li>在室温下以500 × g离心15 ml管5分钟，吸除上清液。将含有球状体沉淀的管子转移至冷冻机（-80 °C）至少3小时。</li>
		<li>解冻管子，加入500 µl细胞裂解试剂（含180 mM NaCl、1 mM EDTA和0.2 mg/ml RNase A）裂解球体。</li>
		<li>作为对照，按上述方法冷冻并裂解已知数量的球状体（最好相当于单次注射所准备的球体数量）。</li>
		<li>1小时后，取100 µl细胞裂解液（设复孔）加入96孔微孔板，每孔加入100 µl 1×细胞裂解缓冲液，其中含有试剂盒提供的细胞增殖检测试剂1:50稀释液。10分钟后测定各孔荧光值，通过将实验样本与对照样本比较，确定未注入的球体数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过检测转移球体产生的PGE2和TSG6浓度，评估用于注射的球状体的活化水平（可选）。如上所述，将40–120个球体通过导管转移至含1或2 ml αMEM（补充2%胎牛血清和1×青霉素/链霉素）的12孔板或6孔板中。将培养板放入培养箱孵育6小时。
	<ol>
		<li>6小时后，将孔中培养基转移至1.5 ml或15 ml管中，在室温下以450 × g离心5分钟。</li>
		<li>用移液器将无细胞上清液转移至新的1.5 ml管中，在室温下以10,000 × g离心5–10分钟。</li>
		<li>将澄清的条件培养基（上清液）转移至新的1.5 ml管中，按照试剂盒说明书使用商用ELISA试剂盒检测PGE2浓度（CM抗炎潜力的良好指标）。TSG6浓度可依据已发表的方案14进行测定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在某些研究和临床应用中，最佳的间充质干细胞（MSC）应处于高度活化状态，以最大化其治疗效益，并优先在化学成分明确的无血清（XF）条件下制备，以减少来自异种培养基成分（如胎牛血清FBS）的潜在抗原递送。在本文所述的实验方案中，我们展示了以下方法：1）通过形成球状体在三维（3D）培养中活化MSC；2）在无血清（XF）条件下实现MSC的三维（3D）活化；3）评估球状体MSC在抗炎、免疫调节及抗肿瘤潜能方面的活化水平；4）将活化的MSC以完整球状体形式递送至小鼠体内。
间充质干细胞（MSCs）是一类多能干细胞，可通过贴壁法从多种成体组织（包括骨髓和脂肪组织）中分离获得。MSCs在组织培养塑料表面易于扩增，通常在相对较高浓度（10–20%）胎牛血清（FBS）条件下培养，表达一组特异性的表面标志物，并至少可向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系分化。1,16,17,<sup class="x...

间充质干细胞/基质细胞（MSCs）在多种再生医学应用中展现出巨大潜力。MSCs最初作为骨髓基质成分被分离获得，此后亦从多种其他成体组织中成功分离，包括脂肪组织。1,2,3有趣的是，主要的分离方法利用了间充质干细胞（MSCs）在胎牛血清（FBS）存在下能够紧密贴附于组织培养塑料表面的显著特性。尽管这种传统的分离技术可在二维（2D）培养条件下实现MSCs的简便且快速扩增，但其人工化程度较高，忽略了细胞所处天然三维（3D）微环境的重要性，可能导致重要细胞特性的丧失4,5,6因此，为了寻找更接近生理条件的培养环境，间充质干细胞在三维培养体系中的研究逐渐兴起，该体系相较于传统的二维培养更具生理相关性 &#34;丢失/减弱&#34; 间充质干细胞的特性。此外，人们越来越关注确定无异源成分（XF）且化学成分明确的间充质干细胞培养与激活条件，从而使这些细胞更适用于临床应用。
已有大量研究发表，展示了间充质干细胞（MSCs）在生物材料中以及以球形聚集体或球体形式进行的三维培养。最初，生物材料中的MSCs培养设计用于组织工程，旨在通过接种细胞的支架来替代受损组织，而MSCs的球体培养则被视为理解MSC行为的一种途径 体内 在临床前或临床试验中给予细胞用于治疗后4,5,7有趣的是，当不允许间充质干细胞黏附于组织培养塑料表面时，它们会自发形成球状体。8,9,10传统上，细胞聚集通过旋转烧瓶法或液体覆盖技术实现，这些方法最初应用于癌症生物学研究，旨在模拟肿瘤微环境。近年来，一些新方法相继出现，通过在培养皿表面预先包被特定化学物质以阻止细胞与塑料表面的黏附，从而实现细胞在体外的聚集。4,5,6一种最简单且经济的生成间充质干细胞（MSC）球体的方法是采用悬滴培养法，该技术常用于从胚胎干细胞中产生类胚体。在悬滴培养技术中，将细胞悬浮于组织培养皿盖内侧的一滴培养基中，通过重力作用促使细胞在液滴顶端聚集，从而避免细胞贴附于组织培养塑料表面。通过调整细胞浓度或液滴体积可方便地调控球体大小，使得悬滴培养法具有良好的可控性。
早期关于间充质干细胞三维培养的研究表明，与二维培养的细胞相比，三维培养的细胞在特性上存在显著差异6,8,9同时，有报告表明间充质干细胞（MSCs）的有益作用 体内 依赖其通过微环境信号被激活的能力，并响应产生抗炎和免疫调节因子11有趣的是，许多这类因子，如前列腺素 E2（PGE2）、肿瘤坏死因子刺激基因 6（TSG6）和肝细胞生长因子（HGF），在间充质干细胞球体（MSC spheroids）中的产量远高于传统的二维培养的间充质干细胞，这为利用三维培养激活细胞的理念奠定了基础8,12,13此外，三维培养中的基因激活似乎在一定程度上重现了细胞注射入小鼠后激活的机制12通过在实验前激活间充质干细胞（MSCs），可延长并增强细胞的作用效果，使其较传统MSC效应更为显著 体内 通常延迟出现且短暂，可被描述为 &#34;一触即离&#34;近年来，利用间充质干细胞球体开展的重要功能研究表明，这些球体能够抑制炎症反应并调节免疫功能 体内 通过影响巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和T细胞等效应细胞，使得球形聚集体成为一种具有吸引力的预处理间充质干细胞形式2,3此外，与单层培养的间充质干细胞（MSCs）相比，三维培养的MSCs中抗癌分子（如白细胞介素-24（IL-24）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL））的产量增加，这一现象可被用于靶向癌症治疗8,10,14.
传统的间充质干细胞（MSC）培养不仅需要使用组织培养塑料，还需要添加胎牛血清（FBS），因此为了使MSC球体更适用于临床应用，必须克服这一障碍。为解决这一问题，我们近期证明了在特定的化学成分明确的无血清（XF）条件下可成功形成MSC球体，并证实所获得的MSC球体能够产生活化状态下的抗炎和抗癌分子，其分泌谱与在含FBS条件下生成的球体相当14。本文详细提供了多个实验方案，展示如何在无血清培养基中通过三维培养技术生成预活化的MSC球体。此外，还提供了评估MSC活化水平的有效方法，涵盖其抗炎、免疫调节及抗癌效应的检测，并介绍了一种将完整球体递送至小鼠体内的实用操作方法。

<table><tbody><tr><td>MEM-&amp;alpha; α-最低必需培养基</td><td>赛默飞世尔科技 / 吉布科</td><td>12561049; 12561056; 12561072</td><td>用于制备间充质干细胞生长培养基（CCM）的最低必需培养基</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清），优质精选</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11595；S11510；S11550；S11595-24</td><td>各类细胞完全培养基的组分</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技/吉布科</td><td>25030081; 25030149; 25030164</td><td>各类细胞完全培养基的组分</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技/吉布科</td><td>15070063</td><td>各类细胞完全培养基的组分</td></tr><tr><td>0.22 微米无菌过滤装置 &amp;micro;m PES 膜</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU01RE；SCGPU02RE；SCGPU05RE；SCGPU10RE；SCGPU11RE</td><td>培养基灭菌</td></tr><tr><td>150 mm 细胞培养皿</td><td>Nunc</td><td>D8554&amp;nbsp;SIGMA</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Thermo Forma 水套式 CO₂ 培养箱&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 湿润培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Model 3110</td><td>培养细胞的孵育</td></tr><tr><td>早期传代的多细胞球体</td><td>德克萨斯A&M大学成人干细胞制备与分发中心&amp;amp;M健康科学中心医学院斯科特再生医学研究所 &amp;和 白色</td><td>NA</td><td>间充质干细胞二维和三维培养的制备</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR</td><td>89501-468</td><td>将培养基预热至37℃ &amp;deg;C</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td>492000904</td><td>手动液体处理</td></tr><tr><td>Pipete-Aid</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-300</td><td>处理血清学移液管</td></tr><tr><td>康宁无菌血清移液管（5、10、25 和 50 ml）</td><td>康宁</td><td>4487; 4101; 4251; 4490</td><td>液体处理</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.4</td><td>赛默飞世尔科技/Gibco</td><td>10010023; 10010072; 10010031; 10010049</td><td>细胞培养处理</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液</td><td>赛默飞世尔科技/吉布科</td><td>25200056; 25200072; 25200114</td><td>消化贴壁细胞并分散细胞团块</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352097</td><td>细胞离心</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352098</td><td>细胞离心</td></tr><tr><td>Eppendor 冷冻离心机</td><td>Eppendorf/Fisher Scientific</td><td>Model 5810R</td><td>细胞离心</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>26716</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154 SIGMA</td><td>血细胞计数板细胞计数过程中的死细胞排除</td></tr><tr><td>成分明确的无异源间充质干细胞培养基-1（XFM-1）</td><td>赛默飞世尔科技/Gibco</td><td>A1067501</td><td>无异源成分培养基，专为人类间充质干细胞的生长与扩增而设计</td></tr><tr><td>成分明确的无异源间充质干细胞培养基-2（XFM-2）</td><td>干细胞技术</td><td>5420</td><td>无明确异种成分的人类间充质干细胞培养基</td></tr><tr><td>HSA（人血清白蛋白）</td><td>双子座</td><td>800-120</td><td>无异源成分MSC培养基组分</td></tr><tr><td>重组人血清白蛋白（rHSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731&amp;nbsp;SIGMA</td><td>无异源成分MSC培养基组分</td></tr><tr><td>总RNA提取小量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>总RNA提取</td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>总RNA提取前的样品匀浆化</td></tr><tr><td>RNase-free DNase 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>总RNA提取过程中柱上DNA的去除</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&amp;nbsp;ALDRICH</td><td>RLT缓冲液中RNase的抑制</td></tr><tr><td>涡旋混合</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td>混合样品</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>NA</td><td>RNA 浓度与质量</td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技/应用生物系统</td><td>4368814</td><td>总RNA转录为cDNA</td></tr><tr><td>基因表达检测</td><td>赛默飞世尔科技/应用生物系统</td><td>有所不同</td><td>实时荧光定量PCR引物/探针组合</td></tr><tr><td>快速通用PCR预混液</td><td>赛默飞世尔科技/应用生物系统</td><td>4352042; 4364103; 4366073; 4367846</td><td>实时荧光定量 PCR 反应用预混液</td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR系统（ABI Prism 7900 HT序列检测系统）</td><td>ABI Prizm</td><td>NA</td><td>实时荧光定量PCR</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>细胞离心、样品采集与保存</td></tr><tr><td>(-80 &amp;deg;C) 冷冻机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>赛默飞 Forma 8695 型</td><td>样品储存</td></tr><tr><td>PGE2（前列腺素 E2）ELISA 试剂盒</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>KGE004B</td><td>样本中细胞因子浓度的测定</td></tr><tr><td>DMEM（Dulbecco）&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基)</td><td>赛默飞世尔科技/吉布科</td><td>10566-016; 10566-024;10566-032</td><td>巨噬细胞培养基</td></tr><tr><td>J774 小鼠巨噬细胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>小鼠巨噬细胞系</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>康宁</td><td>3513</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 巨噬细胞刺激</td></tr><tr><td>LPS（脂多糖）</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4130</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 巨噬细胞刺激</td></tr><tr><td>小鼠 TNF-α ELISA 试剂盒</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MTA00B</td><td>样本中细胞因子浓度的测定</td></tr><tr><td>小鼠IL-10（白细胞介素10）ELISA试剂盒</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>M1000B</td><td>样本中细胞因子浓度的测定</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>赛默飞世尔科技 / 吉布科</td><td>11875-085</td><td>脾细胞培养基</td></tr><tr><td>BALB/c 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>651</td><td>&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt; 球状体递送；脾细胞制备</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3e 功能级纯化抗体</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 脾细胞刺激</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>352350</td><td>脾细胞制备</td></tr><tr><td>红细胞裂解液（1x）</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>00-4333</td><td>脾细胞分离过程中红细胞的去除</td></tr><tr><td>小鼠 IFN-&amp;#947; （γ-干扰素）ELISA 试剂盒</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MIF 00</td><td>样本中细胞因子浓度的测定</td></tr><tr><td>LNCaP 前列腺癌细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>研究三维培养的间充质干细胞对癌细胞系的影响 &lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>基于DNA的细胞增殖检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C7026</td><td>基于DNA含量的细胞数量测定</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>裂解试剂组分</td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FERR1021</td><td>钙螯合剂，裂解试剂组分</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>用于DNA测量的RNA降解</td></tr><tr><td>基于滤光片的多功能微孔板读板仪</td><td>BMG 技术</td><td>NA</td><td>微量滴定板检测（ELISA、细胞定量、 &lt;em&gt;等等。&lt;/em&gt;)</td></tr><tr><td>HBSS（Hank平衡盐溶液），无钙，无镁，无酚红</td><td>赛默飞世尔科技/吉布科</td><td>14175079</td><td>MSC 球体在重新悬浮前的处理 &lt;em&gt;体内&lt;/em&gt; 注射</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>MWI 动物保健供应公司</td><td>502017</td><td>麻醉用于 &lt;em&gt;体内&lt;/em&gt; 注射</td></tr><tr><td>氧气，压缩气体</td><td>普莱克斯</td><td>NA</td><td>用于异氟烷</td></tr><tr><td>Thermo Forma BSL-2 生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Model 1385</td><td>无菌细胞培养</td></tr><tr><td>安全型静脉导管/针芯，20 G，1 英寸</td><td>Terumo</td><td>SR*FNP2025</td><td>将类球体递送至腹腔</td></tr><tr><td>无菌微量移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>有所不同</td><td>液体/细胞处理</td></tr></tbody></table>

在无异源条件下通过三维培养制备并给予治疗性间充质干细胞/基质细胞（msc）球体

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

间充质干细胞/基质细胞（MSCs）在生物工程与再生医学领域具有广阔的应用前景。MSCs 可从多种成体组织中分离获得，其分离基于它们对组织培养塑料的强附着性，随后可进一步扩增 体外，最常用的是胎牛血清（FBS）。由于FBS可能导致间充质干细胞（MSCs）产生免疫原性，其在MSC培养中的存在限制了这些细胞在临床和实验研究中的应用。因此，采用化学成分明确且无异源成分（xeno-free, XF）的培养基培养MSC的研究具有极高价值。MSC的多种有益作用被认为主要归因于其调节炎症和免疫的能力，这种能力主要是通过分泌免疫调节因子实现的，例如肿瘤坏死因子刺激基因6（TSG6）和前列腺素E2（PGE2）。然而，MSC需要被激活才能产生这些因子，且MSC的作用往往具有短暂性，因此目前人们越来越关注如何在使用前对细胞进行预激活，以消除激活所需的滞后时间 体内. 本文介绍了在三维（3D）培养条件下高效激活或启动间充质干细胞（MSCs）的实验方案 在化学成分明确的XF条件下培养，并给予这些预先激活的MSCs 体内具体而言，我们首先描述在XF培养基中利用悬滴法生成球形间充质干细胞微组织或“球体”的方法，并演示如何收集这些球体及其条件培养基（CM）用于各种应用。其次，我们描述基因表达筛选方法。 体外 用于快速评估球状体中MSC活化水平的功能性检测方法，重点突出这些细胞的抗炎和抗癌潜力。第三，我们介绍了一种将完整MSC球状体注射到小鼠腹腔内的新方法 体内 功效测试。总体而言，本文所述方案克服了在化学成分明确的无饲养层条件下获取预激活间充质干细胞的主要难题，并提供了一个灵活的系统，用于递送间充质干细胞球体以开展治疗。

在本研究中，采用悬滴培养法在无外源因子（XF）条件下生成活化的间充质干细胞（MSCs）致密球形微组织或“球状体”。研究路线图如下 图1 表明间充质干细胞（MSCs）在悬滴中悬浮培养72小时后可被诱导自发组装成球体，随后可收集这些球体或含有球体来源治疗因子的条件培养基，并有望用于科研与临床应用。通过以低密度（通常为每平方厘米100–200个细胞）接种MSCs，可在一周内获得球体生成所需的大量细胞。2，然后将细胞培养6-7天，直至汇合度达到约80%（图2）。通过每日计数活细胞确定的细胞生长动力学显示，短暂的1-2天迟滞期之后为一个显著的快速扩增阶段（第3-7天）。图2C第2代或第3代间充质干细胞在CCM培养基中培养时，通常可从一管冻存的100万细胞扩增至5000万至1亿个细胞。
扩增并收获后，将间充质干细胞以高细胞浓度悬浮，以形成球体...

间充质干细胞/基质细胞（MSCs）的治疗潜力已有充分文献记载，但如何制备适用于患者的细胞仍存在争议。本文介绍在无异种成分条件下有效制备和施用经预处理的治疗性MSC球形聚集体（“球体”）的实验方案，适用于实验研究和临床应用。

在无异源条件下通过三维培养制备并给予治疗性间充质干细胞/基质细胞（MSC）球体

间充质干细胞/基质细胞（MSCs）在生物工程与再生医学领域具有广阔的应用前景。MSCs 可通过……从多种成体组织中分离获得。

这些实验的总体目标是高效地生成和注射经无异源条件预处理的间充质干细胞/基质细胞（MSCs）的治疗性球形聚集体（即球体），用于实验和临床应用。这些方法有助于克服MSC治疗领域中的主要障碍，例如分散细胞移植后常见的细胞滞留率低、存活率差和功能不佳，以及与组织损伤相关的不利环境条件。这些操作方法的主要优势在于，MSC 球体的制备、预处理和注射均可在无免疫原性动物源成分（如 FBS）的条件下完成，而 FBS 目前限制了细胞的部分临床应用，也可能干扰部分临床前数据的解读。尽管这一机制在介导基于 MSC 的治疗效果方面具有潜在的重要益处，但它也可用于理解 MSC 介导的组织修复过程，以及不同培养基配方如何改变治疗相关的基因表达谱。本实验操作将由我实验室的两名技术人员 Josh Beaver 和 Bret Clough 进行示范。按照文本方案接种并培养间充质干细胞后，使用胰蛋白酶和EDTA消化细胞，收集细胞并在450 × g条件下离心，将所有细胞合并至一个锥形管中，加入适量培养基。离心后，用少量培养基重悬细胞沉淀。计数细胞后，为形成约25,000个细胞的类球体，将收获的MSCs用以下培养基之一稀释至每微升714个细胞。接下来，将35微升细胞悬液滴加到直径150毫米倒置培养皿盖的底部。向培养皿底部加入20毫升室温磷酸盐缓冲液（PBS），然后连续而稳定地将带有液滴的皿盖翻转，使液滴顶端朝下。随后小心地将皿盖放置在培养皿底部上。将培养皿转移至培养箱中，静置培养三天，期间避免扰动，以确保类球体正常组装。培养结束后，开始类球体收获：小心取下皿盖并翻转，使液滴重新朝上；随后将皿盖倾斜约10至20度，用细胞刮铲将含有类球体的液滴推至培养皿边缘。使用1 mL移液器，将球状体的终末培养基转移至15 mL锥形管中，并使用室温PBS和同一移液器吸头清洗培养板，以确保最大限度回收球状体。进行实时PCR实验时，在室温下以450 × g离心球状体悬液5分钟，然后吸除上清液。用 PBS 洗涤类球体，并重复离心和吸除步骤。若需将类球体递送至动物体内，则无需离心，让类球体自然沉降至管底。为收集条件培养基（CM），用于后续免疫调节及抗肿瘤潜能检测，参照前述方法，使用细胞刮和移液器收集类球体及 CM 培养基至 15 毫升锥形管中。但是，不要用 PBS 清洗盖子。在 450 × g 条件下离心 5 到 10 分钟后，将上清液转移至 1.5 毫升离心管中。随后在室温下以 10,000 × g 离心上清液 5 到 10 分钟。然后使用移液器小心地将澄清的上清液收集到新的1.5毫升离心管中，于-80摄氏度保存。按照本视频刚刚演示的方法制备类球体后，静置3至4分钟使其沉降至管底，吸除上清液，并加入含0.2%至0.5%人血清白蛋白（HSA）的HBSS洗涤类球体，以维持无异源条件。接着，吸除上清液。将 100 至 200

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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