Name: Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Leer hoe HDAC-remmers de epigenetische regulatie van B-celdifferentiatie en antilichaamklasse-switching moduleren via microRNA- en mRNA-expressieanalyse in muizen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de NIH grants AI 105813 en AI 079705 (op PC), toekennen het Bondgenootschap voor Lupus onderzoek Target identificatie in Lupus Grant ALR 295955 (op PC), en het onderzoek van de artritis National Research Foundation (HZ). TS werd gesteund door de kindergeneeskunde Medical Center, tweede Xiangya ziekenhuis, centrale Zuid-Universiteit, Changsha (China), in het kader van het Xiangya-UT School van geneeskunde San Antonio medisch student bezoekende programma.

het protocol volgt de richtlijnen van de verzorging van de dieren van de institutionele zorg van het dier en gebruik commissies van de University of Texas Health Science Center in San Antonio.
 1. stimulatie van de muis B cellen voor MVO, Plasma celdifferentiatie en HDI behandeling <ol><li>voorbereiding van milt cel schorsingen Opmerking: alle stappen in een laminaire flow-kap met uitzondering van de muis euthanasie en dissectie.
	<ol><li>De specifieke pathogenen vrije C57BL/6J muis (8-12 weken oud) CO 2 inademing euthanaseren.</li>
		<li>Leg de muis op ontleden bord met de buik naar boven gericht. PIN alle vier voeten van de muis met 18-gauge, 1,5 - in injectienaalden.</li>
		<li>De huid met behulp van 70% ethanol doordrenkte doekjes steriliseren.</li>
		<li>Gebruik van een set van gesteriliseerde met autoclaaf chirurgische instrumenten (pincet en ontleden schaar) te snijden door de huid net onder de ribbenkast te visualiseren de milt (aan de linkerkant van de buik, net onder de lever).</li>
		<li>Gebruiken een ander steriel pincet en schaar om uit te pakken van de milt, die onder de grotere kromming van de maag, ligt door klemmen van de milt zachtjes met een tang en het afsnijden van alle het aansluitende weefsel met het ontleden van scharen. Zorg ervoor dat alle de aansluitende weefsel verwijderen.</li>
		<li>Plaatst de milt in een buis van de 1.5-mL microcentrifuge met 1.000 µL van volledige RPMI1640 medium (RPMI 1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 µg/mL penicilline, 100 µg Mn/mL streptomycine, 0,25 µg/mL amfotericine B en 50 µM β-mercaptoethanol).</li>
		<li>Plaats een 70-µm cel zeef in een 50 mL polypropyleen conische centrifugebuis en giet de milt van de buis van de microcentrifuge op de zeef van de cel. Hiermee kunt u dat het puntje van een tube van 15 mL polypropyleen conische centrifuge zachtjes Prak de milt door de zeef. Spoel de cel zeef met volledige gemiddeld 15 tot 20 mL.</li>
		<li>Spin down de cellen bij 350 x g gedurende 5 min en negeren het supernatant.</li>
		<li>Verwijder de rode bloedcellen uit de milt cel schorsingen. Resuspendeer de pellet cel in ACK lysis-buffermengsel (5 mL per milt). Incubeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur met af en toe schudden en vervolgens doven met 25 mL van volledige medium.</li>
		<li>Spin down de cellen bij 350 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 1 of 10 mL volledige voedingsbodem. Tellen de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer.</li>
	</ol></li> <li>B-cel isolatie Opmerking: isoleren B cellen door negatieve selectie na de fabrikant &#39; s instructies. Niet-B-cellen zijn gericht voor verwijdering met biotinyleerd antilichamen gericht tegen niet-B cellen (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) en TER119) en daar beklede magnetische deeltjes.
	<ol><li>Voorbereiden een 0.25 tot 2 mL celsuspensie van 1 x 10 8 cellen/mL in volledige medium in een steriele 5 mL (12 x 75 mm) polystyreen ronde onderkant buis. Normale rat serum (50 µL/mL) Voeg aan het monster.</li>
		<li>Toevoegen 50 µL/mL isolatie cocktail aan het monster. Meng de cellen door zachtjes pipetting op en neer 2 - 3 keer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten</li>
		<li>Voeg 75 µL/mL daar beklede magnetische deeltjes aan het monster. Meng het mengsel zachtjes op en neer waarbij 2 - 3 keer en incubeer gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Toevoegen volledige RPMI 1640 medium. Meng de cellen door pipetteren zachtjes op en neer 2 - 3 keer.</li>
		<li>Plaats van de buis (zonder de deksel) in de magneet en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2,5 minuten Pour uit het supernatant met ongerepte B-cellen in een nieuwe conische buis van 15 mL.</li>
		<li>Rekenen de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en Trypan Blue vlek. Beoordelen van de zuiverheid van de B-cellen door stroom cytometry analyse van B-cel oppervlakte markers, zoals B220 en CD19.</li>
	</ol></li> <li>B-cel stimulatie en HDI behandeling <ol><li>resuspendeer de gezuiverde B-cellen in volledige RPMI 1640 medium bij een eindconcentratie van 0,3 x 10 6 cellen/mL.</li>
		<li>Voor cultuur van de cel een 48-well cel cultuur plaat gebruiken. Voor elk putje, voeg 1 mL van gezuiverde B-celsuspensie (0.3 x 10 6 cellen/mL), LPS (eindconcentratie 3 µg/mL) van Escherichia coli, IL-4 (eindconcentratie 5 ng/mL) en 0 of 500 µM HDI (valproic zuur; VPA).</li>
		<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 60 h voor qRT-PCR en high-throughput mRNA - en miRNA-sequencing analyse of 96 uur stroom cytometry p.a..</li>
	</ol></li> <li>Stroom cytometry analyse van MVO en plasma celdifferentiatie <ol><li>na 96 h van de cultuur, de cellen van elk putje loskoppelen door de cellen op en neer meermaals pipetteren. Breng de celsuspensie in een 1.5-mL microcentrifuge buis. Spin down de cellen bij 350 x g gedurende 5 min met behulp van een centrifuge Bank-top en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen met 100 µL van HBSS buffer met 1% BSA en 0,5 ng/mL fluoresceïne (FITC) - geconjugeerd geit anti - muis IgM-antistoffen (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-geconjugeerd rat-antimuis IgG1 Monoclonal Ab (mAb), 0,2 ng/mL phycoerythrin (PE)-geconjugeerd rat anti-muis B220 mAb, 0,2 ng/mL PE-Cy7-geconjugeerde rat anti-muis CD138 mAb en 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).</li>
		<li>Incubeer de cellen met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen (stap 1.4.2) in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten</li>
		<li>Wassen van de cellen met 1 mL HBSS met 1% BSA.</li>
		<li>Spin down de cellen bij 1.500 x g gedurende 5 min met behulp van een benchtop centrifuge en negeren het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 300 µL van HBSS met 1% BSA en de celsuspensie overbrengen in een polystyreen ronde-onderkant-buis. Dekking van de buis met folie om te voorkomen dat blootstelling aan licht.</li>
		<li>Stroom cytometry-analyses uitvoeren op een eencellige suspensie. 250.000 en 50.000 gebeurtenissen voor elk monster vergoeding voor de overige monsters verzamelen. Analyseren van de gegevens met behulp van apparatuur software.</li>
		<li>De puin en de paren elimineren met behulp van een puls-meetkunde gate (FSC-H x FSC-A en WS-H x SSC-A). Poort op de juiste wijze de plot op 7-AAD uit te sluiten van de dode cellen.</li>
	</ol></li></ol> 2. High-Throughput mRNA-Seq <ol><li>na 60 h van cultuur, extract het totaal RNA van 2-4 × 10 6 cellen met behulp van een totale isolatie kit voor RNA die kleine RNA na de fabrikant kan herstellen &#39; s instructies. Omvatten een DNase ik behandeling stap.</li>
	<li>Verifiëren van de integriteit van de RNA met behulp van een bioanalyzer, na de fabrikant &#39; s instructies.</li>
	<li>Gebruik 500-1000 ng van kwalitatief hoogwaardige totaal RNA (RNA integriteit nummer RIN &#62; 8.0) voor RNA-seq sample bibliotheek voorbereiding met een commerciële RNA prep kit na de fabrikant &#39; s instructies.</li>
	<li>Pool van de individuele mRNA-seq-bibliotheken op basis van hun respectieve 6-bp index gedeelten van de adapters en volgorde van de bibliotheken op 50 bp/volgorde. Gebruik van een high-throughput DNA systeem volgens de fabrikant &#39; s protocollen.</li>
	<li>Na de sequencing run, demultiplex met CASAVA voor het genereren van het bestand fastq voor elk monster. Uitvoeren van leest mapping en bioinformatica analyse, zoals eerder beschreven 11.</li>
	<li>Alle sequencing leest met hun referentie genomen (UCSC muis genoom bouwen mm9) met behulp van TopHat2 standaard instellingen 14 uitlijnen Verwerken van de bam-bestanden uit met behulp van HTSeq-graaf te verkrijgen van de graven per gen in alle monsters uitlijning.</li>
</ol> 3. High-Throughput miRNA-Seq <ol><li>gebruik 100 ng-1 µg totaal RNA van hoge kwaliteit, zoals voorbereid stap 2.1, voorbereiding kleine RNA-seq bibliotheek met behulp van een commerciële kit voor kleine RNA-seq.</li>
	<li>Ligate de ontaarde 3 &#39; adapter op de 5 &#8242; uiteinden van de startende kleine molecules van RNA met een commerciële afbinding kit. De ontaarde 5 afbinden &#39; adapter op de 3 &#8242; uiteinden van de startende kleine molecules van RNA met een commerciële afbinding kit. Het RNA omzetten in cDNA door omgekeerde transcriptie en versterken van de kleine RNA-seq-bibliotheek door PCR versterking met commerciële kits.</li>
	<li>Gebruik een 6% TBE inheemse pagina gel te isoleren van de laatste kleine RNA-seq-bibliotheek. De gel worden uitgevoerd met 1 X TBE buffer bij 200 V totdat de band bromophenol-blauwe kleurstof bijhouden de onderkant van de gel (0.5 - 1 cm nadert).</li>
	<li>Verwijderen van de gel uit de glazen platen en vlek met ethidiumbromide (0,5 µg/mL in water) in een schone container voor 2-3 min. visualiseren de gel bands op een UV-transilluminator of een ander gel documentatie instrument.</li>
	<li>Gesneden uit de ~ 150-bp-band met behulp van een schone scheermes en leg deze in een tube van 1,7 mL.</li>
	<li>Extract van het DNA met behulp van een gel extractie kit per fabrikant instructies.</li>
	<li>Check de grootteverdeling van de definitieve bibliotheek met een commerciële ultragevoelige DNA test en de concentratie met een commerciële dsDNA test per de fabrikanten &#39; instructies.</li>
	<li>Pool van de Bibliotheken, versterking en een daaropvolgende sequencing uitgevoerd met een high-throughput DNA sequencing handelsstelsel per de fabrikant &#39; s protocollen.</li>
	<li>Demultiplex met CASAVA voor het genereren van het bestand fastq voor elk monster per de fabrikant &#39; s protocollen.</li>
	<li>Voor kleine RNA-seq analyse van elk monster, flikkering te gebruiken voor kleine RNA uitlijning per de fabrikant &#39; s protocollen.
	<ol><li>Verwijderen leest die zijn uitgelijnd op verontreinigingen, zoals mitochondriën, rRNA, primers, enzovoort.</li>
		<li>De gegevens om oudere miRNA sequenties uitlijnen.</li>
		<li>De gegevens uitlijnen op haarspeld lus sequenties (voorloper van miRNA).</li>
		<li>Uitlijnen de gegevens tot en met andere kleine RNA-sequenties (met behulp van de fRNA database) 15.</li>
	</ol></li> <li>Nadat alle monsters worden gekwantificeerd, definiëren de differentiële uitgedrukt miRNAs tussen verschillende groepen/samples. Voorspellen van miRNAs die gericht zijn op geselecteerde mRNAs of mRNAs die kunnen worden gericht door een selectieve miRNA hulpprogramma's online miRNA doel voorspelling, zoals PicTar, TargetScan 16 en 17 van de microkosmos 18 .</li>
	<li>Als aantekening of traject functionaalanalyse nodig is, dienen de voorspelde genen aan vindingrijkheid Pathway analyse (IPA) of DAVID.</li>
</ol> 4. Kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) van mRNAs en miRNAs <ol><li>qRT-PCR analyse van mRNA <ol><li>Extract RNA van 0.2-5 × 10 6 cellen met behulp van een commerciële totaal RNA isolatie kit die van kleine RNA herstellen kan, na de fabrikant &#39; s instructies. Omvatten een DNase ik behandeling stap.</li>
		<li>CDNA uit totaal RNA met een eerste fronten cDNA synthese systeem met behulp van oligo-dT primer synthetiseren.</li>
		<li>Kwantificeren van cDNA door qRT-PCR met passende primers, 2 x real-time PCR master mix met het volgende protocol: 95 ° C gedurende 15 s, 40 cycli van 94 ° C voor 10 s, 60 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s.</li>
		<li>Het uitvoeren van data-acquisitie tijdens de stap van de uitbreiding 72 ° C en smeltende kromme analyse uitvoeren van 72 naar 95 ° C.</li>
	</ol></li> <li>qRT-PCR analyse van miRNA <ol><li>aliquoot RNA van de monsters bereid in stap 4.1.1.</li>
		<li>Reverse-transcriberen het RNA in cDNA. Gebruik een commerciële microRNA omgekeerde transcriptie kit, na de fabrikant &#39; s instructies.</li>
		<li>PCR in real time voor microRNA met behulp van een SYBR groen real-time PCR master mix met 250 nM volwassen miRNA voorwaartse inleidingen in combinatie met een universele omgekeerde primer uitvoeren.
		<ol><li>Dooi 2 x universele omgekeerde PCR Master Mix en miRNA-specifieke voorwaartse primer primer op kamertemperatuur. Vermeng de individuele oplossingen.</li>
			<li>Voorbereiden op een mix van de reactie als volgt een volume van 25 µL-per-well reactie (gebruikt in 96-wells-platen voor PCR): 2 x µL van het PCR Master Mix 12,5 miRNA toekomen inleidingen (2,5 μM) 2.5 µL universele primer (2,5 μM) reverse 2.5 µL RN ASE-vrije water5 µL</li> <li>toevoegen 22,5 μL van reactie mix aan een 96-Wells PCR plaat. 2.5 µL van sjabloon cDNA (50 ng van de pg-3) toevoegen aan de afzonderlijke plaat putjes.</li>
			<li>Strak afdichting van de plaat-film. Centrifugeer de plaat voor 1 min op 1000 x g en kamertemperatuur.</li>
			<li>Plaats van de plaat in de real-time cycler en beginnen de volgende fietsen programma: 95 ° C gedurende 5 min, 40 cycli van 94 ° C voor 15 s, 55 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s.</li>
		</ol></li> <li>De ΔΔCt-methode voor data-analyse qRT-PCR met een werkblad gebruiken. Normaliseren van de uitdrukking van de relevante miRNAs uitdrukking van kleine nucleaire/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2 Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68, en Snord70/SNORD70.</li>
	</ol></li> <li>Statistische analyse <ol><li>uitvoeren van statistische analyse om te bepalen van de p-waarden door gekoppeld en ongepaarde Student &#39; s t - test met behulp van een werkblad en overwegen van p-waarden &#60; 0,05 zoals aanzienlijke.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Allis, C. D., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+hallmarks+of+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The molecular hallmarks of epigenetic control.</a> Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23643790">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).</li>
<li>Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+Peripheral+B-Cell+Differentiation+and+the+Antibody+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response.</a> Front Immunol. 6, 631(2015).</li>
<li>Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+class-switch+DNA+recombination%3A+induction%2C+targeting+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).</li>
<li>White, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+upregulate+B+cell+microRNAs+that+silence+AID+and+Blimp-1+expression+for+epigenetic+modulation+of+antibody+and+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses.</a> J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).</li>
<li>Farh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+fine+mapping+of+causal+autoimmune+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants.</a> Nature. 518, 337-343 (2015).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
<li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).</li>
<li>Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+selective+modulation+of+microRNAs+and+mRNAs+by+histone+deacetylase+inhibitor+in+B+cells+induced+to+uUndergo+class-switch+DNA+recombination+and+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation.</a> Front. Immunol. 6, 627(2015).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Kin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fRNAdb%3A+a+platform+for+mining%2Fannotating+functional+RNA+candidates+from+non-coding+RNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).</li>
<li>Anders, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((doRiNA%3A+a+database+of+RNA+interactions+in+post-transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol biedt uitgebreide benaderingen om te induceren van B-cel klasse schakelen en plasma celdifferentiatie; voor het analyseren van de gevolgen daarvan door epigenetische modulatoren, namelijk HDI; en het effect van HDI op mRNA en miRNA expressie in deze cellen worden opgespoord. De meeste van deze benaderingen kan ook worden gebruikt voor het analyseren van de impact van epigenetische factor op menselijke expressie van B-cel functie en mRNA/miRNA. De qRT-PCR en mRNA-seq/miRNA-seq benaderingen kunnen ook worden g...

Epigenetische merken of factoren, zoals methylation van DNA, histone posttranslationele modificaties en niet-coderende RNAs (inclusief microRNAs), moduleren functie cel door gene expression1te wijzigen. Epigenetische aanpassingen reguleren B-lymfocyt functie, zoals immunoglobulin klasse-switch DNA recombinatie (CSR), somatische hypermutation (SHM) en differentiatie geheugencellen B of plasmacellen, waardoor het moduleren van het antilichaam en autoantibody Reacties2,3. MVO en SHM vereisen kritisch activering-geïnduceerde cytosinetrifosfaat Dipyridamol (steun, gecodeerd als Aicda), die zeer wordt geïnduceerd in B cellen in reactie op T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigenen4. Klasse-geschakeld/hypermutated B cellen verder differentiëren tot plasmacellen, die grote volumes van antilichamen in een mode kritisch afhankelijk van rijping B-lymfocyt-geïnduceerde proteïne afscheiden 1 (Blimp1, gecodeerd als Prdm1)5. Abnormale epigenetische veranderingen in de B-cellen kunnen leiden tot afwijkende antilichaam/autoantibody reacties, die tot allergische reactie of autoimmuniteit1,4 leiden kunnen. Begrijpen hoe epigenetische factoren, zoals miRNAs, moduleren B-cel-intrinsieke genexpressie is niet alleen belangrijk voor de ontwikkeling van een vaccin, maar is ook essentieel om te onthullen van de mechanismen van potentieel abnormale antilichaam/autoantibody reacties.
Histon acetylation en deacetylation zijn wijzigingen van de lysine residuen op Histon eiwitten meestal gekatalyseerd door Histon acetyltransferase (hoed) en histone deacetylase (HDAC). Deze wijzigingen leiden tot de toenemende of dalende toegankelijkheid van de chromatine en verdere toestaan of voorkomen van de binding van transcriptiefactoren of proteïnen aan DNA en de wijziging van gen expressie5,6, 7 , 8. HDAC-remmers (HDI) vormen een klasse van verbindingen die met de functie van HDACs interfereren. Hier, we gebruikten HDI (VPA) inspelen op de regulering van HDAC op de intrinsieke genexpressie profiel van B-cellen en zijn mechanisme.
miRNAs zijn kleine, niet-coderende RNAs ongeveer 18 tot en met 22 nucleotiden in lengte die worden gegenereerd door verschillende stadia. miRNA host genen worden getranscribeerd en vormen haarspeld primaire microRNAs (pri-miRNAs). Ze worden geëxporteerd naar het cytoplasma waar pri-miRNAs verder worden verwerkt tot voorloper miRNAs (pre-miRNAs). Ten slotte, volwassen miRNAs worden gevormd door de splitsing van de pre-miRNAs. miRNAs herkennen de aanvullende reeksen binnen de 3' niet-vertaalde regio van hun doel mRNAs6,7. Via post-transcriptional tot zwijgen brengen, regelen miRNAs cellulaire activiteit, zoals de proliferatie en differentiatie apoptosis10,11. Aangezien meerdere miRNAs zich op de dezelfde mRNA richten kunt en één enkele miRNA mogelijk meerdere mRNAs kunt richten, is het belangrijk dat een weergave van de in het kader van de miRNA expressie profiel te begrijpen de waarde van het individu en het collectief effect van miRNAs. miRNAs is aangetoond te worden betrokken bij de ontwikkeling van de B-cel en perifere differentiatie, evenals fase-specifieke B-celdifferentiatie, antistofrespons tegen en autoimmuniteit1,4,9. In de 3' UTR van Aicda en Prdm1zijn er verschillende gevalideerde of voorspelde evolutionair geconserveerde sites die kunnen worden gericht door miRNAs8.
Epigenetische modulatie, met inbegrip van Histon na transcriptie wijziging en miRNAs, een celtype en cel fase-specifieke reglementering patroon van gen expressie9weergeven We beschrijven hier, methoden om te definiëren van de HDI-gemedieerde modulatie van miRNA en mRNA uitdrukking, MVO en plasma celdifferentiatie. Deze omvatten protocollen voor inducerende B cellen ondergaan van MVO en plasma celdifferentiatie; voor de behandeling van de B-cellen met HDI; en voor het analyseren van miRNA en mRNA uitdrukking door qRT-PCR, miRNA-seq en mRNA-seq10,11,12,8,13.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 muizen</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X met L-Glutamine (Grootte: 6 x 500mL; Met L-Glutamine)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT 10-040-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH300</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Antibiotic Antimycotic Oplossing 100 mL</td><td>Fisher Scientific - Hyclone</td><td>SV3007901&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-420-3250ML</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>21008-952&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0.04%</td><td>GIBCO/Life Technologies/Inv</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW10-548E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes met Dop</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse B cell Isolation Kit</td><td>Stem Cell Tech</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>BD Naald Alleen 18 Gauge 1.5 inch KORT BEVEL 100/doos&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>&nbsp;305199</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-muis CD138 (Syndecan-1) Antilichaam</td><td>BioLegend&nbsp;</td><td>142513 (25 ug)</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 B220 antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD (1 mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-muis/mens CD45R/B220 antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>103212</td><td></td></tr><tr><td>Muis APC-IgG1 200 &micro;g</td><td>Biolegend</td><td>406610</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-muis IgM Antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>406506</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-muis/mens CD45R/B220 Antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Human/Muis CD45R (B220) (RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-21-022-CM</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine, Fractie V, Warmteshockbehandeld&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>LPS 25mg (Lipopolysacchariden uit Escherichia coli 055:B5)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2880-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant muis IL-4 (carrier-free)</td><td>BioLegend</td><td>574302 (grootte: 10 ug)</td><td></td></tr><tr><td>Valproïnezuur natriumzout</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>SterilGARD e3 Klasse II Type A2 Bioveiligheidskast</td><td>The Baker Company</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Grote capaciteit Reach-In CO2 Incubator&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5Q</td><td></td></tr><tr><td>5mL Ronde Bodem Polystyreen Testbuisje</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp;14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Corning CentriStar 15ml Centrifugebuizen&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-538-59A</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL Microbuisje, helder</td><td>Genesee</td><td>22-282</td><td></td></tr><tr><td>Hoge Snelheid Easy Reader Plastic Centrifugebuizen 50ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>ELMI SkySpin CM-6MT</td><td>ELMI</td><td>CM-6MT</td><td></td></tr><tr><td>Rotor 6M</td><td>ELMI</td><td>6M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor 6M.06</td><td>ELMI</td><td>6M.06</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Draagbare Pipet-Aid XP Pipet Controller</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serologische pipettentips</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische pipettentips</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serologische pipettentips</td><td>Fisher Scientific</td><td>898130-896</td><td></td></tr><tr><td>48-wells platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Niet-Gekoeld</td><td>Beckman Coulter</td><td>366802</td><td></td></tr><tr><td>GH-3.8A Rotor, Horizontaal, ARIES Smart Balance</td><td>Beckman Coulter</td><td>366650</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Gekoeld</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>TA-15-1.5 Rotor, Vaste Hoek</td><td>Beckman Coulter</td><td>368298</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific AccuSpin Micro 17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (Ong. 0,75% Ethanol als Conserveermiddel/Moleculair Biologie)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Vrije Dnase set (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrofotometers</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III First-strand Synthese Systeem RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>175013897</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>172-5121</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Platen, verpakking van 25</td><td>Fisher</td><td>14-230-244</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Adhesive Seals</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB-1001</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ Optics Module</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9744</td><td></td></tr><tr><td>iCycler Chassis</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8701</td><td></td></tr><tr><td>Optical Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9752</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II Flow Cytometry Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10</td><td>BD

genoom-brede analyse van hdac-inhibitor-gemedieerde modulatie van micrornas en mrnas in b cellen geïnduceerde undergo klasse-switch dna recombinatie en plasma celdifferentiatie

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Antilichaam reacties zijn bereikt door verschillende kritische B-cel-intrinsieke processen, met inbegrip van somatische hypermutation (SHM), klasse-switch DNA recombinatie (CSR) en plasma celdifferentiatie. In de afgelopen jaren is epigenetische veranderingen of factoren, zoals Histon deacetylation en microRNAs (miRNAs), gebleken om te interageren met de B-cel genetische programma's vorm antilichaam reacties, terwijl de disfunctie van epigenetische factoren blijkt te leiden tot autoantibody reacties. Het analyseren van genoom-brede miRNA en mRNA uitdrukking in B cellen in reactie op de epigenetische modulatoren is belangrijk voor het begrijpen van de Epigenetische regulatie van de B-cel functie en antilichaam reactie. Hier tonen we een protocol voor inducerende B cellen ondergaan van MVO en plasma cel differentiatie, behandelen deze B-cellen met histone deacetylase (HDAC) remmers (Hotel) en analyseren van mRNA en microRNA expressie. In dit protocol, analyseren we rechtstreeks aanvullende opeenvolgingen van DNA (cDNA) met behulp van volgende-generatie mRNA sequencing (mRNA-seq) en miRNA-seq technologieën, in kaart brengen van de volgorde leest aan het genoom, en kwantitatieve omgekeerde transcriptie (qRT)-PCR. Met deze aanpak, die we hebben gedefinieerd dat in B cellen geïnduceerde ondergaan MVO en plasma celdifferentiatie, HDI, een epigenetische regulator, selectief miRNA en mRNA uitdrukking moduleert en verandert van MVO en plasma cel differentiatie.

Met behulp van onze protocol, gezuiverd B cellen geplaatst met LPS (3 µg/mL) en IL-4 (5 ng/mL) voor 96 h 30-40% van MVO te IgG1 en ~ 10% van plasma celdifferentiatie kan veroorzaken. Na behandeling met HDI (500µM VPA), de CSR aan IgG1 verlaagd naar 10-20%, terwijl plasma celdifferentiatie tot ~ 2 daalde % (Figuur 1). HDI-gemedieerde remming van MVO was verder bevestigd door verminderde aantallen na recombinatie Iμ-Cγ1 en volwassen VH-DJH-afschriften ...

Epigenetische factoren kunnen communiceren met genetische programma's voor het moduleren van genexpressie en de regulering van de B-cel functie. Door stimulatie van de in vitro B-cel, qRT-PCR, en high-throughput microRNA-sequence en mRNA-sequence benaderingen te combineren, kunnen we analyseren de epigenetische modulatie van miRNA en gen-expressie in B-cellen.

Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

Het algemene doel van dit experiment is om B-lymfocyten te induceren tot antilichaam-klasseswitching en plasmaceldifferentiatie, en om de modulatie alsmede de epigenetische regulatie door de expressie van HDAC-remmer mRNA en microRNA in B-cellen te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de B-cel antilichaamrespons, zoals de epigenetische modulatie van immunoglobuline-klasseswitching en plasmaceldifferentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode biedt om B-cel functies te moduleren en om de verandering van microRNA's en mRNA's door epigenetische regulatoren te definiëren.Na het euthanaseren van een specifieke pathogeenvrije C57BL6J-muis en het steriliseren van de huid volgens het tekstprotocol, gebruikt u geautoclaveerde pincetten en dissectiescharen om de huid net onder de ribbenkast door te snijden om de milt aan de linkerzijde van de buikholte, net onder de lever, zichtbaar te maken. Klem de milt voorzichtig vast en knip al het verbindingsweefsel door voordat u het orgaan verwijdert. Plaats de milt vervolgens in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 1 000 microliters com

genome-wide-analysis-hdac-inhibitor-mediated-modulation-micrornas

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit protocol beschrijft hoe chromatine immunoprecipitatie (ChIP) wordt gebruikt om de dynamische wijzigingen studie naar de chromatine sjabloon die transcriptie veroorzaakt door een signaal transductie route te reguleren.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) om Assay Dynamic histon-eiwitten in Actieve genexpressie in menselijke cellen

Hier presenteren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) procedure voor genoom-brede locatie analyse van eiwit-isovormen die verschillen in een histon-bindend domein. We zijn toe te passen op ChIP-Seq analyse om de doelstellingen van het KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase te identificeren.

Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

Na blootstelling aan antigeen, subpopulaties van geactiveerde B-cellen worden onderworpen aan een proces dat bekend staat als klasse switch recombinatie (CSR) van antilichamen isotypen te produceren met verschillende effector functies. Het protocol beschreven in dit rapport legt uit hoe MVO kan worden opgewekt en...

Inductie en beoordeling van klasse Switch recombinatie in gezuiverd Murine B-cellen

In dit protocol beschrijven we een nieuwe BrdU-ChIP-Slot-Western techniek om eiwitten en histonmodificaties te onderzoeken die geassocieerd zijn met nieuw gesynthetiseerd of nagenoeg DNA.

Onderzoek van eiwitten gebonden aan ontluikende DNA in zoogdiercellen met behulp van BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek

De huidige methode dient ter identificatie van isovorm-specifieke remmers van Histon deacetylases (HDAC) in HeLa cellen door de UHPLC-MS-analyse van meerdere substraten. Dit is een antilichaam-vrije methode ontwikkeld om te reflecteren van HDAC1 en HDAC6 activiteit in de levende cel omgeving, in tegenstelling tot één-isovorm cel-gratis testen.

Gelijktijdige meting van HDAC1 en HDAC6 activiteit in HeLa cellen met behulp van UHPLC-MS

Dit werk beschrijft een protocol voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van een volwassen T-cellijn van de muis. Dit protocol is geschikt om de verdeling van specifieke histonenmerken op specifieke promotor sites of genoombreed te onderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Hier beschrijven we een protocol voor het chromatine immunoprecipitation van gemodificeerde histonen uit de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wordt vervolgens gebruikt voor kwantitatieve PCR te ondervragen de overvloed en lokalisatie van Histon posttranslationele modificaties in het genoom.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Met behulp van scriptingregel cultuur systemen, wij brengen verslag een in vitro B-cel plasma cel differentiatie model.

In Vitro differentiatie Model van menselijke normale B geheugencellen te langlevende plasmacellen

Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

Hier bieden we een protocol voor het screenen van potentiële transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van dendritische cel (DC) met behulp van lentivirale transductie van shRNA om stabiele knockdown-cellijnen te verkrijgen voor in vitro DC-differentiatie.

Studie van dendritische celontwikkeling door korte haarspeld RNA-gemedieerde gen knockdown in een hematopoëtische stam en voorlopercellijn in vitro

Leer hoe HDAC-remmers de epigenetische regulatie van B-celdifferentiatie en antilichaamklasse-switching moduleren via microRNA- en mRNA-expressieanalyse in muizen.

Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie (Video) | JoVE Journal

Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie

Meer video's verkennen