Targeted membrana plasmatica di consegna di un idrofobo Cargo incapsulato in un cristallo nanoparticelle Carrier Liquid

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di utilizzare una nanoparticella a cristalli liquidi come piattaforma di rilascio per la somministrazione controllata di un dicargo idrofobico alla porzione lipofila della membrana plasmatica di cellule di mammifero viventi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della somministrazione di farmaci, ad esempio come consentire in modo efficiente la somministrazione e l'assorbimento cellulare di carichi idrofobici scarsamente solubili in acqua. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una consegna più specifica di carichi idrofobici mirati alla membrana plasmatica, insieme alla loro ridotta citotossicità.

A dimostrare la procedura sarà il Dr.Okhil Nag, un postdoc del mio laboratorio. Iniziare questa procedura con la preparazione della nanoparticella a cristalli liquidi DiO come descritto nel protocollo di testo. Quindi, aggiungere 20 microlitri di soluzione di lavoro appena preparata di NHSS/EDC a 1,0 millilitri di nanoparticella a cristalli liquidi DiO in tampone HEPES.

E mescolate per cinque minuti. Quindi, aggiungi 20 microlitri di una soluzione madre di colesterolo PEG ammina a questa miscela e mescola per due ore. Dopo due ore, centrifugare brevemente la miscela di reazione alla massima velocità per 30 secondi utilizzando una mini centrifuga da tavolo.

Quindi passare il surnatante attraverso una colonna cromatografica ad esclusione di dimensioni PD 10 bilanciata con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco. Per confermare il successo della coniugazione covalente del colesterolo PEG sulla superficie delle nanoparticelle a cristalli liquidi DiO mediante elettroforesi su gel, preparare un gel di agarosio come descritto nel protocollo di testo. Una volta che il gel si è solidificato, aggiungere una quantità sufficiente di tampone di corsa TBE per immergere il gel nella camera.

Quindi, aggiungere 35 microlitri di campione di nanoparticelle a cristalli liquidi DiO ai pozzetti del gel e far funzionare per 20 minuti a una tensione di 110 volt. Visualizzare il gel utilizzando un sistema di imaging su gel con un filtro di eccitazione a 488 nanometri e filtri di emissione da 500 a 550 nanometri. Preparare piastre per colture tissutali di 35 millimetri di diametro dotate di inserti in vetro di copertura numero uno da 14 millimetri rivestendole con fibronectina bovina in DPBS per due ore a 37 gradi Celsius.

Dopo due ore, rimuovere la soluzione di rivestimento con fibronectina dal piatto di coltura. Raccogliere le cellule HEK 293 T17 dal pallone T25 lavando prima il monostrato di cellule con tre millilitri di DPBS e poi aggiungendo due millilitri di tripsina EDTA. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius per circa tre minuti.

Una volta staccate le cellule dal pallone, neutralizzare la tripsina aggiungendo quattro millilitri di terreno completo al pallone. Determinare la concentrazione di cellule nella sospensione contandole in un contatore di cellule. Quindi regolare la concentrazione cellulare a circa 80.000 cellule per millilitro con il terreno di crescita.

Aggiungere tre millilitri di sospensione cellulare al piatto e la coltura nell'incubatore per una notte. Il giorno successivo, le celle dovrebbero essere a circa il 70% di confluenza e pronte per l'uso. Un'adeguata densità cellulare è fondamentale per una marcatura robusta ed efficiente di un'alta percentuale di cellule.

Preparare soluzioni da un millilitro di DiO, nanoparticelle a cristalli liquidi DiO e nanoparticelle di colesterolo PEG a cristalli liquidi DiO, nel terreno di consegna diluendo le corrispondenti soluzioni stock. Rimuovere il terreno di coltura dalle piastre di coltura utilizzando una pipetta sierologica e lavare i monostrati cellulari due volte con HEPES DMEM. Eseguire i lavaggi utilizzando una pipetta per aggiungere delicatamente HEPES DMEM al bordo delle stoviglie, quindi rimuoverlo.

Aggiungere 0,2 millilitri delle soluzioni preparate per la somministrazione di nanoparticelle a cristalli liquidi DiO o DiO al centro delle piastre di coltura. Quindi rimettere le piastre nell'incubatrice per un periodo di tempo adeguato. Tempi di incubazione più lunghi portano a una marcatura cellulare non specifica di aree non membranose.

Trascorso il periodo di incubazione, rimuovere le soluzioni di somministrazione utilizzando una pipetta sierologica. Lavare i monostrati cellulari due volte con DPBS utilizzando due millilitri per ogni lavaggio. Fissare i monostrati cellulari utilizzando il quattro percento di paraformaldeide per 15 minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere la soluzione di paraformaldeide utilizzando una pipetta e lavare delicatamente le cellule una volta con due millilitri di DPBS. Ora le cellule fissate sono pronte per essere visualizzate per la presenza di un segnale fluorescente membranoso, utilizzando la microscopia a scansione laser confocale. Su un tavolino da microscopio dotato di una camera di incubazione riscaldata, è possibile visualizzare il campione di cellule vive utilizzando un microscopio confocale per valutare l'etichettatura della membrana.

Se l'imaging non viene eseguito immediatamente, sostituire il terreno con DPBS contenente lo 0,05% di sodio azide e conservare le piastre a quattro gradi Celsius. In questo metodo, le cellule sono comarcate con DiO come donatore FRET e DiI come accettore FRET. Etichettare le vendite in sequenza con DiO a cristalli liquidi nanoparticelle PEG colesterolo e DiI libero come prima.

Dopo la colorazione, lavare le cellule una volta con due millilitri di DPBS utilizzando una pipetta sierologica e sostituirle con due millilitri della soluzione di imaging delle cellule vive. Su un tavolino da microscopio dotato di una camera di incubazione riscaldata, visualizzare il campione di cellule vive utilizzando un microscopio confocale con imaging FRET. Configura l'esperimento per intervalli di 30 minuti in un periodo di quattro ore eccitando il donatore di DiO a 488 nanometri e raccogliendo spettri di emissione completi sia del donatore di DiO che dell'accettore di DiI da 490 a 700 nanometri, con un rivelatore spettrale a 32 canali.

Quindi, determinare l'intensità di emissione risolta nel tempo sia del donatore DiO che dell'accettore DiI da cellule colorate con DiO, nanoparticelle di cristalli liquidi, colesterolo PEG e DiI. Infine, calcola il rapporto FRET del donatore accettore risolto nel tempo per le immagini come descritto nel protocollo di testo. Il DiO libero si accumula in modo non specifico all'interno della cellula, piuttosto che nelle membrane plasmatiche delle cellule che sono state controcolorate con un fosfolipide di membrana dimarcato.

Questo può essere visualizzato con le immagini unite. Al contrario, la nanoparticella di colesterolo PEG a cristalli liquidi DiO etichetta specificamente solo la membrana plasmatica della cellula, come visualizzato dalla colocalizzazione con il fosfolipide di membrana dimarcato. FRET conferma la diopartizione dalla nanoparticella a cristalli liquidi nel doppio strato lipidico di membrana attraverso un aumento osservato del trasferimento di energia dal donatore di DiO all'accettore di DiI.

Il FRET tra DiO e DiI, così come le variazioni di emissione di DiO e DiI, confermano l'aumento del FRET da DiO a DiI in funzione del tempo. Le nanoparticelle di colesterolo PEG a cristalli liquidi DiO mostrano una citotossicità minima al 90% di vitalità, rispetto alla tossicità significativa per DiO libero a circa il 50% di vitalità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare nanoparticelle di cristalli liquidi caricate con carico, biofunzionalizzarle per il targeting cellulare e visualizzare le celle caricate con carico per una consegna cellulare di successo.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la somministrazione specifica di DiO dalla soluzione acquosa alla membrana plasmatica è una sfida significativa. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo dopo aver utilizzato la piattaforma di nanoparticelle a cristalli liquidi per la somministrazione cellulare del farmaco antitumorale doxorubicina e aver visto la sua capacità di modulare la cinetica di assorbimento cellulare del farmaco. Seguendo questa procedura, questo approccio può essere implementato per la consegna cellulare di un'ampia gamma di carichi idrofobici che rappresentano una sfida particolare per quanto riguarda la loro consegna alle cellule da mezzi acquosi.

Questo approccio può essere utilizzato per ottenere una somministrazione più efficiente di farmaci mirati alla membrana e molecole bioattive, come coloranti sensibili al voltaggio per l'imaging cerebrale o farmaci fotodinamici per la terapia farmacologica fotonica assistita.