Name: Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Erfahren Sie das induzierbare T7-vermittelte Multigen-Expressionssystem pMGX für simultane Proteinexpression in Escherichia coli. Diese Methode ermöglicht die Konstruktion synthetischer Operons aus einem Plasmid.

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Diese Arbeit wurde vom Naturwissenschaften und Ingenieurforschungsrat von Kanada unterstützt.

1. Erhalten von Genen von Interesse <ol><li> Design synthetische Gene. <ol><li> Optimieren Sie eine Gensequenz für die E. coli- Expression. </li><li> Entfernen Sie alle problematischen Restriktionsstellen aus der Sequenz (AvrII, NdeI, EcoRI und XbaI). </li><li> Einbindung von Restriktionsstellen für das Klonen; Eine 5&#39;-NdeI-Stelle und eine 3&#39;-EcoRI-Stelle werden empfohlen. Andere Standorte können bei Bedarf verwendet werden; Beziehen sich auf den Multicloning-Bereich des ausgewählten Plasmids ( Abbildung S1- S4 ). Falls gewünscht, bitte ein 5 &#39;oder 3&#39; Codierungs-Tag für die Western-Blot-Erkennung. </li><li> Kommerziell das entworfene Gen bestellen </li><li> Entweder stumpf klon das Gen in einen stumpfen Vektor unter Verwendung eines stumpfen Klonierungskits, wie nach den Anweisungen des Herstellers; Design-Primer zur Amplifikation des Gens (dann weiter mit Schritt 1.2.2); Oder zusätzliche 5&#39;- und 3&#39;-Enden zur direkten Klonierung in ein pMGX-Plasmid hinzufügen und mit Schritt 2 fortfahrenDie repräsentativen Ergebnisse stammen aus dem stumpfen Klonen der Gene von Interesse. </li></ol></li><li> Amplifizieren des gewünschten Gens (aus einem entworfenen und optimierten synthetischen Gen oder aus Templat-DNA, die das gewünschte Gen enthält) 15 . <ol><li> Design-Primer mit Restriktionsstellen für das Klonen; Eine 5&#39;-NdeI-Stelle und eine 3&#39;-EcoRI-Stelle werden empfohlen. Andere Standorte können bei Bedarf verwendet werden; Beziehen sich auf den Multicloning-Bereich des ausgewählten Plasmids ( Abbildung S1- S4 ). Wenn gewünscht, bitte entweder ein 5 &#39;oder 3&#39; Codierungs-Tag für Western Blot-Erkennung. </li><li> PCR amplifiziert das gewünschte Gen 15 . </li><li> Analysieren Sie die PCR durch Agarosegelelektrophorese 16 . </li><li> Wenn es unspezifische Amplifikation gibt, reinigen Sie das amplifizierte Gen durch Gel-Extraktion. Wenn nicht, verwenden Sie ein Enzym-Clean-up-Kit. </li><li> Quantifizierung der DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers durch Überprüfung des AbsorptionsmittelsE bei 260 nm; Leer mit Elutionspuffer 17 . </li></ol></li></ol> 2. Klonen von Genen von Interesse in ein Multigene Expression System Vector, pMGX 18 <ol><li> Die Beschränkung verdrängt das erhaltene Gen von Interesse und den gewünschten Vektor, pMGX, mit NdeI und EcoRI. HINWEIS: Wenn eine große Menge an rezirkulierten Plasmiden erhalten wird, lassen Sie die NdeI-Reaktion 1 h vor der Zugabe von EcoRI ablaufen. <ol><li> Verwenden Sie eine 40 μl Digest-Reaktion mit 0,5-1,5 μg DNA und 1 μl jedes Enzyms mit 4 μl des entsprechenden 10x Puffers. </li><li> Für einen NdeI- und EcoRI-Digest verwenden Sie EcoRI-Puffer und fügen Sie zuerst NdeI-Endonuklease hinzu. Digest für 1 h bei 37 ° C. Dann füge EcoRI-Endonuklease hinzu und lasse den Digest für eine weitere Stunde ablaufen. NdeI ist empfindlich gegenüber Spaltungen nahe am Ende der DNA, so dass die anfängliche Verdauung durch EcoRI eine wirksame Verdauung durch NdeI verhindern kann. </li></ol></li><li> ElektrOphorese die Restriktionsverdauung auf Agarosegel (für ein 1 kb-Gen, verwenden Sie ein 0,7% Agarosegel bei 110 V für 55 min, um den Prozentsatz des Agarosegels für unterschiedliche Gengrößen auszuwählen, siehe Referenz 16 . </li><li> Exzisionseinsatz und Vektorbänder mit einem sauberen Skalpell oder Rasierklinge und legen das ausgeschnittene Gelsegment in ein 1,5 mL Röhrchen. </li><li> Extrahieren Sie die DNA aus dem Agarosegel mit einem Gel-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Ligieren Sie das Gen von Interesse in den pMGX-Vektor unter Verwendung eines 3: 1-Insert-zu-Vektor-Verhältnisses; Eine negative Ligation von verdautem pMGX ohne den Einsatz einrichten. <ol><li> Stellen Sie eine 20 &amp; mgr; l Ligationsreaktion ein, die 1 &amp; mgr; l T4-DNA-Ligase, 0,15-0,5 &amp; mgr; g Vektor-DNA (&amp; ndash; 5 &amp; mgr; l) und eine geeignete Menge an Insert auf der Basis eines 3: 1-Insert-zu-Vektor-Verhältnisses und der Grße von &amp; lgr; Das Gen wird eingefügt; Die pMGX-Backbones sind zwischen 5.312 und 5.504 bp groß. Füge eine Negativkontrolle ein, die alles enthältWenn das Gen eingefügt wird. Sicherstellen, dass die Menge an Vektor-DNA in der Negativkontrollligatur äquivalent ist und der Vektor plus Insert-Ligationsreaktionen. </li></ol></li><li> Transformieren von Ligationsreaktionen in XL1-Blue-chemisch kompetente E. coli- Zellen und ligierte Plasmide pMGX- yfg1 (enthaltendes Gen von Interesse 1), pMGX- yfg2 (enthaltendes Gen von Interesse 2) ... pMGX- yfgn (mit Gen von Interesse n). Verwenden Sie aseptische Technik (innerhalb eines Biosicherheitskabinetts oder unter einer Flamme). <ol><li> 100 μl Aliquots von chemisch kompetenten XL1-Blue E. coli auf Eis für 5 min auftauen und dann 5 μl der Ligationsreaktionen hinzufügen. Inkubieren für 30 min auf Eis. </li><li> Schütteln Sie die Zellen für 45 s in einem Wasserbad, das bei 42 ° C gehalten wird, und fügen Sie dann 200 &amp; mgr; l kaltes LB hinzu. Inkubieren sie auf Eis für 2 min. </li><li> Schütteln Sie die Zellen bei 37 ° C, 220 U / min für 1 h und dann die Platte 100 μl auf eine LB-Agar-Platte, die eine Zulassung enthält,Eine vorwählbare Markierung (entweder Ampicillin oder Kanamycin). </li></ol></li><li> Screen die Klone für positive Transformanten. <ol><li> Vergleichen Sie die Kolonie zählt auf der negativen Kontrolle und Ligation Platten. Ein Kolonenzählungsverhältnis größer als 1: 2 ist erwünscht. Wenn es eine große Anzahl von Kolonien auf der negativen Kontrollplatte gibt, gehen Sie zurück zu Schritt 2.1 und überprüfen Sie die Notiz. </li><li> Wählen Sie aus jeder Ligationsreaktion der verschiedenen Gene, die zum Screening (1 n) eingefügt wurden, 4-8 einzelne Kolonien (abhängig von der Negativkontrolle: Ligationsverhältnis) und inokulieren Sie eine 4 ml LB und die entsprechende Antibiotika-Übernachtkultur / Einzelkolonie. Wachsen Sie Kulturen über Nacht mit Schütteln bei 37 ° C und 220 U / min. </li><li> Isolieren Sie Plasmid-DNA unter Verwendung eines Plasmid-DNA-Isolationskits gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Richten Sie eine 20 μl NdeI + EcoRI-Digest-Reaktion ein, die 150-500 ng DNA und 1 μl jedes Enzyms mit 2 μl des entsprechenden 10x Puffers enthält. In thIst der Fall, füge NdeI und EcoRI zur gleichen Zeit hinzu, dass das Gen von Interesse zwischen den Restriktionsstellen liegt. Eine negative Kontrolle mit dem leeren pMGX-Vektor wird empfohlen. Digest für 2 h bei 37 ° C im Wasserbad. </li></ol></li></ol> 3. Einfügen von Gen 2 in den pMGX-Vektor, der das Gen 1 enthält, pMGX- yfg1 <ol><li> Restriktions-Digest pMGX- yfg1 mit AvrII und behandeln mit Kalb-Darm-Phosphatase (CIP). <ol><li> Verwenden Sie eine 40 μl Digest-Reaktion, die 0,5-1,5 μg Vektor-DNA (~ 5-10 μl isolierte DNA) und 1 μl AvrII mit 4 μl des entsprechenden 10x Puffers enthält. Digest für 1,5 h bei 37 ° C und füge dann 1,5 μl CIP hinzu. Lassen Sie es bei 37 ° C für weitere 30 min. </li></ol></li><li> Restriktionsverdauung pMGX- yfg2 mit AvrII und XbaI, um das Gen von Interesse zu befreien. <ol><li> Verwenden Sie eine 40 μl Digest-Reaktion, die 0,5-1,5 μg DNA und 1 μ enthält, L jedes Enzyms mit 4 &amp; mgr; l des geeigneten 10 × Puffers. Digest für 2 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Elektrophorese Restriktion verdaut auf einem entsprechenden Prozent (0,7%) Agarosegel und verbraucht die Insert- und Vektorbänder mit einem sauberen Skalpell / Rasierklinge (siehe Schritte 2.2-2.3). </li><li> Extrahiere die DNA mit einem Gel-Extraktionskit nach dem Protokoll des Herstellers und quantifiziere die DNA 17 . </li><li> Ligat-Gen 2 in pMGX- yfg1 unter Verwendung eines 3: 1-Insert-to-Vektor-Verhältnisses. Richten Sie eine negative Ligation von verdautem pMGX- yfg1 ohne den zusätzlichen Einsatz ein. Einrichten wie oben in Schritt 2.5. </li><li> Verwandeln Sie 5 μl der Ligationsreaktionen in XL1-Blue-chemisch kompetente E. coli- Zellen, ligierte Plasmide pMGX- yfg1,2 (enthaltendes Gen von Interesse 1 und 2) und eine negative pMGX- yfg1- Kontrolle, wie in Schritt 2.6 zu sehen ist. </li><li> Vergleichen Sie die Koloniezahl auf die Negativkontrolle und Ligationsplatten. Ein Kolonienzahlverhältnis gReater als 1: 2 ist erwünscht. Wenn es eine große Anzahl von Kolonien auf der negativen Kontrollplatte gibt, gehen Sie zurück zu Schritt 3.1 und überprüfen Sie die CIP-Behandlung. </li><li> Wählen Sie aus der Ligationsreaktion 4-8 Einzelkolonien (abhängig von der Negativkontrolle: Ligationsverhältnis) und inokulieren Sie 4 ml LB plus das entsprechende Antibiotikum pro Einzelkolonie und wachsen über Nacht bei 37 ° C und 220 U / min. </li><li> Isolieren Sie Plasmid-DNA unter Verwendung eines Plasmid-DNA-Isolationskits gemäß dem Protokoll des Herstellers und quantifizieren Sie die DNA 17 . </li><li> Screen die effektive Insertion des zweiten Gens durch Durchführen einer Restriktionsverdauung von pMGX- yfg1,2 mit EcoRI. <ol><li> Verwenden Sie eine 20 μl Digest-Reaktion, die 150-500 ng DNA und 1 μl EcoRI-Enzym enthält, mit 2 μl EcoRI 10x Puffer. Digest für 2 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Elektrophorese die Restriktionsverdauung auf einem geeigneten prozentualen Agarosegel; Suche nach einer Band, die korrespondiertS auf die Größe des Gens 2 (siehe Schritt 2.2). Ein Gen kann in den Vektor in die unerwünschte, umgekehrte Orientierung einfügen. </li></ol> 4. Hinzufügen eines dritten Gens in den pMGX-Vektor, der die Gene 1 und 2 enthält, pMGX- yfg1,2 <ol><li> Beschränkung digest pMGX- yfg1,2 mit AvrII und behandeln mit CIP, wie in Schritt 3.1 gesehen. </li><li> Einschränkung digest pMGX- yfg3 mit AvrII und XbaI, wie in Schritt 3.2 gesehen. </li><li> Elektrophorese die Restriktion verdaut auf einem geeigneten Prozent Agarosegel und Exzisionseinsatz und Vektorbänder unter Verwendung einer sauberen Skalpell / Rasierklinge; Siehe Schritte 2.2-2.3. </li><li> Extrahieren Sie die DNA aus dem Agarosegel mit einem Gel-Extraktionskit und quantifizieren Sie die DNA 17 . </li><li> Ligat-Gen 3 in pMGX- yfg1,2 unter Verwendung eines 3: 1-Insert-to-Vector-Verhältnisses und stellte eine negative Ligation von verdautem pMGX- yfg1,2 ohne ein zusätzliches Insert auf, wie in Schritt 3.5 zu sehen ist. </li><li> Umwandlung von 5 μl der Ligationsreaktionen in XL1-blaue chemisch kompetente E. coli- Zellen, ligiertes Plasmid pMGX- yfg1,2,3 (enthaltende Gene von Interesse 1, 2 und 3) und negative pMGX- yfg1,2- Kontrolle, wie in Schritt 2.6 gesehen. </li><li> Vergleichen Sie die Koloniezahl auf die Negativkontrolle und Ligationsplatten. Wenn es eine große Anzahl von Kolonien auf der negativen Kontrollplatte gibt, gehen Sie zurück zu Schritt 4.1 und überprüfen Sie die CIP-Behandlung. </li><li> Wählen Sie aus der Ligationsreaktion 4-8 einzelne Kolonien (abhängig von der Negativkontrolle: Ligationsverhältnis) und 4xL LB plus das entsprechende Antibiotikum pro Einzelkolonie inokulieren; Über Nacht bei 37 ° C und 220 U / min wachsen. </li><li> Isolieren Sie die Plasmid-DNA unter Verwendung eines Plasmid-DNA-Isolationskits gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Screen die effektive Insertion des dritten Gens durch Durchführen einer Restriktionsverdauung von pMGX- yfg1,2,3 mit EcoRI, wie in Schritt 3.10 gesehen. </li><li> Elektrophorese die Restriktionsverdauung auf einem geeigneten prozentualen Agarosegel; SchauFür Banden, die den Größen von Gen 2 und Gen 3 entsprechen (siehe Schritt 2.2). Anmerkung: Gen 3 kann in den Vektor in der unerwünschten, umgekehrten Orientierung einfügen. Wenn die Gene 2 und 3 die gleiche Größe haben, muss eine andere geeignete Beschränkungs-Digest-Site für das Screening ausgewählt werden. HINWEIS: Wiederholen Sie, wie es für jedes neue Gen benötigt wird. </li></ol> 5. Herstellung von Proteinen von Interesse mit einem Multigene Expression System und Bewertung der Produktion durch Western Blotting <ol><li> Verwandeln Sie den positiven Klon, der alle Gene von Interesse enthält, in chemisch kompetente Proteinproduktion E. coli , wie BL21- (λDE3). <ol><li> 100 μl Aliquote von chemisch kompetenten BL21- (λDE3) E. coli auf Eis für 5 min auftauen und dann 1 μl der positiv klonierten Plasmid-DNA zugeben; 30 min auf Eis inkubieren </li><li> Schütteln Sie die Zellen für 45 s in einem Wasserbad, das bei 42 ° C gehalten wird, und fügen Sie dann 200 &amp; mgr; l kaltes LB hinzu. Inkubieren auf Eis für 2 min. </li><li>Schütteln Sie die Zellen bei 37 ° C und 220 U / min für 1 h und dann die Platte 100 μl auf eine LB-Agar-Platte, die den geeigneten selektierbaren Marker (entweder Ampicillin oder Kanamycin) enthält. </li></ol></li><li> Expression des Proteins durch Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) Induktion. <ol><li> Wählen Sie eine isolierte Kolonie aus der B21- (λDE3) Transformationsplatte und inokulieren Sie 4 ml LB plus das entsprechende Antibiotikum; Wachsen über Nacht und schütteln bei 37 ° C und 220 U / min. </li><li> Inokulieren Sie eine 100 ml LB plus die entsprechende antibiotische Kultur mit 1 ml über Nacht Kultur. </li><li> Bei 37 ° C unter Schütteln bei 220 U / min auf eine OD 600 von 0,6 wachsen. </li><li> Die Kultur mit 100 μM IPTG induzieren und 15 h bei 25 ° C und 220 U / min wachsen lassen. </li><li> 1 ml der Kultur entfernen und bei 13000 xg für 1 min zentrifugieren; Den Überstand verwerfen. </li></ol></li><li> Lyse die Zellen mit Lyse-Lösung gemäß den Anweisungen des HerstellersUnd präformieren einen Western-Blot des löslichen Zelllysats, um festzustellen, ob alle Proteine ​​erfolgreich produziert wurden 19 . </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Koexpression mehrerer Gene ist immer wichtiger, insbesondere bei der Charakterisierung und Rekonstitution komplexer, multigener Stoffwechselwege 3 , 4 , 5 . Das pMGX-System macht die Multigene-Koexpression in der E. coli- Routine 6 , 7 , 8 und ist für verschiedene Forscher zugänglich. In dieser Studie wurden fünf Proteine ...

Die Koexpression mehrerer Proteine ​​ist zunehmend von wesentlicher Bedeutung, vor allem in synthetischen Biologieanwendungen, bei denen mehrere Funktionsmodule ausgedrückt werden müssen 1 ; Bei der Untersuchung von Protein-Protein-Komplexen, wo Expression und Funktion oft Co-Expression 2 , 3 erfordern; Und bei der Charakterisierung und Nutzung von Biosynthesewegen, wo jedes Gen im Weg ausgedrückt werden muss 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Eine Reihe von Systemen wurde für die Co-Expression entwickelt, insbesondere im Wirtsorganismus Escherichia coli , dem Arbeitspferd für die rekombinante Protein-Expression des Labors 9 . Zum Beispiel können mehrere Plasmide mit unterschiedlichen selektierbaren Markern verwendet werden, um einzelne Proteine ​​unter Verwendung einer Fülle von verschiedenen ex zu exprimieren<html> Druckvektoren 10 , 11 . Einzelne Plasmidsysteme für die multiple Proteinexpression haben entweder mehrere Promotoren verwendet, um die Expression jedes Gens 10 , 12 zu kontrollieren; Synthetische Operons, wo mehrere Gene auf einem einzigen Transkript 2 , 13 codiert sind; Oder in einigen Fällen ein einzelnes Gen, das für ein Polypeptid kodiert, das letztlich proteolytisch verarbeitet wird, wobei die gewünschten interessierenden Proteine 14 erhalten werden . <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> Abbildung 1: pMGX-Workflow, der den Aufbau eines polycistronischen Vektors zeigt. Das pMGX-System bietet eine flexible, einfach zu bedienende Strategie für den Bau von synthetischen Operons unter der Kontrolle eines induzierbaren T7-Promotors.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. In diesem Manuskript wird die Verwendung eines hochwirksamen Systems für die Konstruktion von multigenen synthetischen Operons unter der Kontrolle einer induzierbaren T7-RNA-Polymerase ( Fig. 1 ) beschrieben. Dieses System erlaubt es, dass viele Gene gleichzeitig aus einem Plasmid exprimiert werden. Es basiert auf einem Plasmidsystem, das ursprünglich pKH22 genannt wurde und das für eine Reihe von verschiedenen Anwendungen 6 , 7 , 8 erfolgreich eingesetzt wurde . Hier wird dieser Plasmidsatz um vier verwandte Vektoren erweitert: pMGX-A, ein Expressionsvektor ohne C- oder N-terminale Markierungen und mit dem Ampicillin-Resistenzmarker; PMGX-hisA, ein Expressionsvektor, der für ein N-terminales Hexahistidin-Tag und mit dem Ampicillin-Resistenzmarker kodiert; PMGX-K, ein Expressionsvektor lAcking alle C- oder N-terminalen Markierungen und mit dem Kanamycin-Resistenz-Marker; Und pMGX-hisK, ein Expressionsvektor, der für ein N-terminales Hexahistidin-Tag und mit dem Kanamycin-Resistenzmarker kodiert. In dieser Studie wird das Verfahren zur Erzeugung eines polycistronischen Vektors, der fünf Gene enthält, unter Verwendung des pMGX-Systems, insbesondere pMGX-A, zusammen mit der erfolgreichen Produktion jedes einzelnen Proteins in Escherichia coli gezeigt .

<table><tbody><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase, Kälberdarm (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Neu England Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA-Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Reagenzien1 kb DNA-Leiter</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) chemisch komeptente Zellen</td><td></td><td></td><td>Comeptente Zelle, die im eigenen Haus hergestellt</td></tr><tr><td>wurde B-PER Extraktionsreagenz für bakterielle Proteine</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Mix</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Lieferung mit Polymerase-Gel-Extraktionskit</td></tr><tr><td></td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Gelextraktion, geliefert von VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Antikörper [HRP], mAb, Maus</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemilumineszierend HRP Substrat</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurisiertes Instant-Magermilchpulver</td><td>Lokales Lebensmittelgeschäft</td><td></td><td>No-Name-Milch aus dem Lebensmittelgeschäft ist ausreichend</td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membran PT 0,45 &; Mikro; m 200 mm x 4 m, geliefert von VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Isolation Kit</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, geliefert von VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Anfrage vom Boddy Lab Kontakt cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primer</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td>Entwerfen Sie Primer nach Bedarf für das gewünschte Gen</td></tr><tr><td>Synthetische Gene</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Design und Optimierung nach Bedarf</td></tr><tr><td>: Thick-Blot-Filterpapier</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue chemisch kompetente Zellen Kompetente Zelle</td><td></td><td></td>, <td>die im Haus hergestellt</td></tr> wird<tr><td>Name</td><td> Firma</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpektrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Gelbox - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophorese</td></tr><tr><td>Cell Gel Imager</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>Inkubator-Backofen</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Inkubator-Schüttler</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Rasierer</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR Deutschland</td><td>M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal, geliefert von Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Apparatur</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Zelle</td></tr></tbody></table>

induzierbares t7-rna-polymerase-vermitteltes multigen-expressionssystem, pmgx

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Die Co-Expression mehrerer Proteine ​​ist für die synthetische Biologie immer wichtiger, studiert Protein-Protein-Komplexe und charakterisiert und nutzt Biosynthesewege. In diesem Manuskript wird die Verwendung eines hochwirksamen Systems für die Konstruktion von multigenen synthetischen Operons unter der Kontrolle einer induzierbaren T7-RNA-Polymerase beschrieben. Dieses System erlaubt es, dass viele Gene gleichzeitig aus einem Plasmid exprimiert werden. Hier ist ein Satz von vier verwandten Vektoren, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K und pMGX-hisK, entweder mit dem Ampicillin- oder Kanamycin-resistente Marker (A und K) und entweder mit einem N-terminalen Hexahistidin oder einem N-terminalen Hexahistidin Tag (seine) werden offenbart. Detaillierte Protokolle für die Konstruktion von synthetischen Operen, die dieses Vektorsystem verwenden, werden zusammen mit den entsprechenden Daten bereitgestellt, was zeigt, dass ein pMGX-basiertes System, das fünf Gene enthält, leicht konstruiert und verwendet werden kann, um alle fünf codierten Proteine ​​in Escherichia coli zu produzieren . Dieses systEm und Protokoll ermöglicht es Forschern, routinemäßig komplexe Mehrkomponentenmodule und Wege in E. coli auszudrücken.

In dieser Studie war es das Ziel, fünf Proteine ​​aus einem einzigen Plasmid zu exprimieren. Die Fünf-Codon-optimierten synthetischen Genfragmente, die entweder N- oder C-terminale Hexahistidin-Markierungen codieren, wurden kommerziell gekauft. Die synthetischen Gene wurden durch PCR amplifiziert und einzeln in einen PCR-stumpfen Vektor kloniert und sequenziert. Um das polycistronische Plasmid zu erzeugen, wurden die fünf interessierenden Gene zuerst in ein geeignetes pMGX-Plasmid pMGX-A...

Diese Studie beschreibt Methoden für die T7-vermittelte Co-Expression von mehreren Genen aus einem einzigen Plasmid in Escherichia coli unter Verwendung des pMGX-Plasmidsystems.

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, synthetische Multigen-Operons unter der Kontrolle einer induzierbaren T7-RNA-Polymerase zu konstruieren, um mehrere Proteine gleichzeitig zu exprimieren. Diese Methode kann Forschern in der synthetischen Biologie und Biochemie helfen, indem sie die Erstellung von Multiprotein-Wegen ermöglicht oder die Untersuchung von Protein-Komplexen, die auf eine Ko-Expression mehrerer Ansätze angewiesen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die gleichzeitige Expression mehrerer Gene in Escherichia coli aus einem einzigen Plasmid ermöglicht.Den Versuch aus meinem Labor demonstrieren Mohamed Hassan, ein Doktorand, und Angela Thompson, eine Praktikantin. Nachdem die Gene des Interesses gemäß dem Textprotokoll gewonnen und amplifiziert wurden, bereiten Sie die Verdauungsreaktionen für das erste Gen des Interesses und den pMGX-Faktor vor. Verwenden Sie eine 40-Mikroliter-Reaktion mit 0,5 bis 1,5 Mikrogramm DNA in das Indel-Enzym.Die Reaktionen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend EcoRI hinzufügen und den Verdau weitere eine Stunde lang fortsetzen lassen. NdeI wird vor EcoRI zugegeben, um sicherzustellen, dass der Verdau effektiv erfolgt.NdeI ist empfindlich gegenüber der Länge der doppelsträngigen DNA auf beiden Seiten der Restriktionsstelle. Die Zugabe zuerst stellt sicher, dass es das vollständige zirkuläre Plasmid schneidet. Laden Sie die Verdauungsreaktionen auf ein 0,7 %iges Agarosegel auf und führen Sie die Elektrophorese der Proben bei 100 Volt für 55 Minuten durch.Entfernen Sie anschließend mit einem sauberen Skalpell oder Rasierklinge die Bande von Insert und Vektor und geben Sie die ausgeschnittenen Gelstücke in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Reinigen Sie die DNA mithilfe eines Gel-Extraktionskits gemäß dem schriftlichen Protokoll. Bereiten Sie eine 20-Mikroliter-Ligationsreaktion vor, die 0,15 bis 0,5 Mikrogramm Vektor-DNA, die je nach Größe des Gens geeignete Menge an Insert und ein Mikroliter T4-DNA-Ligase enthält.Unter aseptischen Bedingungen 100&nbsp;Mikroliter-Aliquote chemisch kompetenter XL1-Blue E.coli-Zellen fünf Minuten lang auf Eis auftauen. Anschließend fünf Mikroliter der Ligationsansätze, die ein Gen von Interesse enthalten, zu den Zellen hinzufügen. Die Transformationsansätze 30&nbsp;Minuten auf Eis inkubieren.Erhitzen Sie die Zellen anschließend 45 Sekunden lang in einem Wasserbad mit 42 Grad Celsius. Danach stellen Sie die Transformationen auf Eis und geben 200 Mikroliter kaltes LB-Medium hinzu. Lassen Sie die Zellen zwei Minuten lang inkubieren.Die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 220 Umdrehungen pro Minute eine Stunde lang inkubieren und 100 Mikroliter auf LB-Agarplatten mit einem geeigneten selektierbaren Marker auftragen. Um Kolonien auf mögliche Transformanten zu screenen, vergleichen Sie die Anzahl der Kolonien auf der negativen Kontrolle mit der auf den Ligationsplatten. Ein Verhältnis der Kolonienzahlen von eins zu zwei ist erwünscht.Wählen Sie vier bis acht einzelne Kolonien aus jeder Ligationsreaktion aus, um 4 Milliliter LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum anzusetzen. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute. Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit dem Plasmid-DNA-Isolationskit gemäß dem schriftlichen Protokoll und bereiten Sie 20-Mikroliter-Digesterreaktionen mit 150 bis 500 Nanogramm DNA unter Verwendung von jeweils einem Mikroliter NdeI und EcoRI vor.Die Verdauungsreaktionen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um Gen zwei in den pMGX-Vektor, der Gen eins enthält, einzufügen, eine 40-Mikroliter-Verdauungsreaktion ansetzen, die 0,5 bis 1,5 Mikrogramm Vektor-DNA mit dem ersten Gen der Untersuchung und ein Mikroliter AVR2 enthält. Die Reaktion 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, bevor 1,5 Mikroliter Calf-intestinale Phosphatase hinzugefügt werden.30 Minuten länger inkubieren. Danach eine 40-Mikroliter-Verdauungsreaktion aufsetzen, die 0,5 bis 1,5 Mikrogramm des pMGX-Vektors mit dem zweiten Gen von Interesse enthält. Dazu ein Mikroliter AVR2 und xpol verwenden.Die Reaktion 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Restriktionsverdauungsprodukte auf einem 0,7%-Agarosegel elektrophoretisch trennen. Den Insert und die Vektorbänder mit einem sauberen Skalpellradierer herausschneiden, wie zuvor gezeigt.Nach der Extraktion der Plasmid-DNA und der Quantifizierung der Probe gemäß dem Textprotokoll ein Ligationsansatz mit einem 3:1 Insert-zu-Vektor-Verhältnis von Gen 2 und pMGX-yfg1 aufsetzen. Einen negativen Kontrollansatz mit nur pMGX-yfg1 einbeziehen. Fünf Mikroliter jedes Ansatzes in XL1-Blue-Zellen transformieren, wie zuvor gezeigt.Vergleichen Sie anschließend die Kolonienanzahl auf der Negativkontrolle- und den Ligationsplatten. Wenn sich auf der Negativkontrollplatte eine große Anzahl von Kolonien befindet, überprüfen Sie die CIP-Behandlung. Wählen Sie vier bis acht einzelne Kolonien aus der Ligationsreaktion aus und verwenden Sie jeweils eine Kolonie, um vier Mikroliter LB mit dem entsprechenden Antibiotikum anzusiedeln.Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute kultivieren. Nach der Isolierung und Quantifizierung der Plasmid-DNA wie zuvor beschrieben, auf effektive Insertion des zweiten Gens mittels eines Verdauungsansatzes prüfen, der 150 bis 500 Nanogramm DNA und ein Mikroliter EcoRI enthält. Die Ansätze zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.Für Screening-Zwecke wird EcoRI empfohlen, jedoch können in einigen Fällen mit EcoRI zwei oder mehr Inserte ähnlicher Größe erzeugt werden, die im Gel schwer voneinander zu unterscheiden sind. Zur Sicherstellung des Erfolgs sollte ein alternatives Restriktionsverdauungsenzym wie NdeI verwendet werden. Trennen Sie die Verdauungsreaktionen in einem Agarosegel und suchen Sie nach einem Band, das der Größe des eingefügten Gens 2 entspricht.Klonen Sie zusätzliche Gene in das Plasmid gemäß dem Textprotokoll. Um das polycistronische Plasmid zu erzeugen, wurden die fünf Gene zunächst in ein geeignetes Plasmid, pMGX A, kloniert. Diese Abbildung zeigt pCR-Blunt-yfg1 und pCR-Blunt-yfg2 im pMGX A-Plasmid sowie pMGX A, das mit indel und EcoRI verdaut wurde. Um die ersten beiden Gene in pMGX A zu klonen, wurde das Plasmid mit indel und EcoRI verdaut.Nach dem Klonieren wurden pMGX-yfg1 und pMGX-yfg2 mit AVR2 und xpol digeriert, um zu bestätigen, dass erfolgreiche Klone erhalten wurden. Diese Abbildung zeigt den pMGXyfg1-Vektor, der mit AVR2 digeriert wurde, und den pMGX-yfg2-Vektor, der mit AVR2 und xpol digeriert wurde, um das Gen der Interesse zwei zu isolieren. Das resultierende Insert wurde in pMGX-yfg1 geklont, um den pMGX-yfg1-zwei-Vektor zu erzeugen.Wie hier zu sehen ist, bestätigte die Verdauung von pMGX-yfg1 zwei mit EcoRI die erfolgreiche Klonierung des Gens der Interesse Nummer zwei in pMGX-yfg1. Dieses Gelelektrophoresebild zeigt den Unterschied zwischen verdauten Plasmiden, die entweder die Insertion in korrekter oder in umgekehrter Orientierung aufweisen. Bei einer Insertion in umgekehrter Orientierung liegen zwei EcoRI-Stellen in unmittelbarer Nähe zueinander, wodurch die resultierenden verdauten 50-Basenpaar-Fragmente im Gel nicht nachweisbar sind und das Vektorskelett größer erscheint.Schließlich bestätigt eine Westernblot-Analyse der exprimierten Proteine nach der Erzeugung eines fünfgeningen polyzystronischen Expressionsvektors, dass alle fünf Proteine von einem einzigen Vektor exprimiert wurden. Beachten Sie, dass das von yfg5 produzierte Protein die gleiche Größe wie yfg1 aufweist und im Gel nicht getrennt wird. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei bis vier Tagen pro eingefügtem Gen in das pMGX-Backbone abgeschlossen werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Vektor mit einer Phosphatase wie der Kälberdarmphosphatase zu behandeln und zu linearisieren, um den fünf Vektor zu dephosphorylieren. Nach diesem Verfahren können weitere Experimente wie die multigenetische Expression in vivo durchgeführt werden, um biosynthetische Stoffwechselwege zur Herstellung natürlicher Produkte zu charakterisieren und nutzbar zu machen oder um Protein-Protein-Komplexe zu untersuchen. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der synthetischen Biologie, komplexe Kohlenhydrate und genetisch veränderte E. coli herzustellen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das Multigen-Expressions-System in E. coli implementiert wird.

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

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