Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Het algemene doel van deze video is het beschrijven van de methode voor sequencing van psoralen-crosslinked ligated and selected hybrids of SPLASH, waarbij paarsgewijze in vivo RNA-RNA-interacties op genoombrede schaal in kaart worden gebracht. Deze techniek is een eenvoudige methode met een hoge doorvoersnelheid voor het in kaart brengen van RNA-interacties in vivo. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de RNA-genomics, zoals de wijze waarop verschillende regio's langs een enkele RNA-streng of tussen verschillende RNA-strengen met elkaar interageren.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in gist- en menselijke cellen, kan deze ook worden toegepast op studies naar andere moderne organismen, waaronder bacteriën en celmembranen. We kregen het eerste idee voor deze methode toen we een manier zochten om moleculaire interacties in kaart te brengen. Let op dat de volgende procedure verschillende stoppunten bevat.

Op deze momenten kan het experiment kortstondig of onbepaald worden onderbroken. Details hiervoor zijn te vinden in de begeleidende tekst. Begin deze procedure door HeLa-cellen twee keer te wassen met vijf milliliters PBS.

Plaats de schaal gedurende één minuut verticaal om alle overtollige PBS volledig af te laten lopen. Voeg vervolgens één milliliter PBS toe met 200 micromolar gebiotinyleerd psoralen en 0,01% digitonine, wat de celpermeabiliteit verhoogt. Let erop dat de oplossing gelijkmatig over het oppervlak van de cellen wordt toegevoegd.

Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C. Verwijder na de incubatie het deksel van de schaal en plaats deze op ijs in een UV-crosslinker op drie centimeter afstand van de UV-lamp. Bestraal gedurende 20 minuten met UV-licht van 365 nm.

Verwijder na 20 minuten de schaal uit de Crosslinker, isoleer vervolgens het fragment en precipiteer het RNA uit HeLa-cellen volgens de instructies in het bijbehorende document. Breng een gedenatureerde ladder en de RNA-monsters aan op een 8,6 centimeter vierkante 6%TBE-ureumgel. Voer fractionering op grootte uit via elektroforese bij 180 volt gedurende 40 minuten.

Kleur de gel gedurende vijf minuten in het donker in 10 milliliters TBE-buffer die een 1:10.000 verdunning van nucleic acid gel stain bevat. Terwijl de gel kleurt, gebruik een 24 gauge naald om een schone 0,6 milliliter microcentrifugebuis aan de onderkant te doorprikken. Plaats deze in een twee milliliter microcentrifugebuis.

Visualiseer de banden op de achteraf gekleurde gel met een transilluminator en snijd een gelplakje uit dat overeenkomt met 90 tot 110 nucleotiden. Breng het gelplakje over in de geperforeerde 0,6 milliliter microcentrifugebuis in de twee milliliter microcentrifugebuis. Grootteselectie stelt ons in staat om de minimale lengte voor de chimere fragmenten vast te stellen en om later onderscheid te maken tussen geligeerde producten en niet-geligeerde producten.

Centrifugeer de gelsecties bij 12, 000 ×g bij kamertemperatuur gedurende twee minuten om de gelsectie te versnipperen en deze te verzamelen in de microcentrifugebuis van twee milliliter. Gooi na het centrifugeren de lege microcentrifugebuis van 0,6 milliliter weg. Voeg 700 µL elutiebuffer toe aan de versnipperde gelsectie.

Incubeer gedurende de nacht bij vier graden Celsius onder constante rotatie om diffusie van de monsters in de buffer mogelijk te maken. Breng de gelplakjes en de elutiebuffer over naar een centrifugebuisfilter en centrifugeer bij 20.000 ×g gedurende 20 minuten. Na het centrifugeren blijven de gelplakjes achter in het bovenste compartiment van het filter, dat kan worden weggegooid.

Precipiteer en kwantificeer het RNA zoals beschreven in het bijbehorende document. Bevries het RNA snel en bewaar het bij -80 °C in vloeibare stikstof tot aan gebruik. Om RNA-crosslinkingregio's te verrijken, begint u met het toevoegen van 100 µL lysisbuffer met RNase-remmer om streptavidine-gecoate magnetische beads in een microcentrifugebuis te wassen.

Voeg twee milliliter vers bereide hybridisatiebuffer, één milliliter aangevulde lysisbuffer, 1,5 microgram fractie-gescheiden RNA en 100 microliter geresuspendeerde beads toe aan een conische centrifugebuis van 15 milliliter. Vortex de buis voorzichtig. Incubeer 30 minuten bij 37 graden Celsius met end-to-end rotatie.

Was na de incubatie de beads vijf keer met voorverwarmde wasbuffer. Plaats na de vijfde wasbeurt de microcentrifugebuis met de beads gedurende één minuut op het magneetrek en verwijder vervolgens de wasbuffer. Voeg één milliliter koud T4 polynucleotide kinase-buffer toe aan de gewassen beads.

Incubeer de beads gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius met kop-staartrotatie. Plaats de microcentrifugeebuis met de beads op de magnetische strip. Verwijder na één minuut voorzichtig de buffer.

Herhaal deze stap voor in totaal twee wasbeurten en verwijder de buffer na de laatste wasbeurt. Volg vervolgens de instructies in het bijbehorende document om de 5'- en 3'-uiteinden ligatie-compatibel te maken en voer de proximiteitsligatie uit. Voeg na een wasbeurt 100 µL RNA PK-buffer toe aan de beads en resuspendeer deze door herhaaldelijk op te zuigen en uit te pipetteren.

Verhit de monsters 10 minuten lang bij 95 °C op een warmteblok. Koel het monster vervolgens één minuut lang op ijs. Voeg 500 µL guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform toe aan het monster.

Meng door 10 seconden krachtig te vortexen. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik na de incubatie een kit om het RNA neer te slaan, te zuiveren en terug te winnen, waarbij moet worden gewaarborgd dat zelfs kleine RNA's behouden blijven.

Elueer het RNA in 100 µL nuclease-vrij water. Draag 100 µL van de elueerde monsters over naar een putje van een 24-wellplaat op ijs. Bestraal het monster met UV-licht bij 254 nm gedurende vijf minuten, terwijl het monster op ijs blijft.

Breng het omgekeerd gecrosslinkte monster over naar een schone microcentrifugebuis. Voeg 10 µL natriumacetaat, 1 µL glycogeen en 300 µL 100% ethanol toe. Precipiteer het RNA bij -20 °C gedurende ten minste één uur.

Om het RNA terug te winnen, centrifugeert u het geprecipiteerde RNA bij 20,000 ×g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en voeg 1 mL koude 70% ethanol toe om het RNA-pellet te wassen. Centrifugeer het gewassen pellet bij 20,000 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C.

Verwijder de wasbuffer en voeg 4,25 µL nucleasevrij water toe om het RNA opnieuw op te lossen. Breng het RNA over naar een 0,2 mL PCR-buisje. Voer ten slotte de reverse transcriptie, circularisatie en amplificatie van het cDNA uit volgens de instructies in het bijbehorende document.

Dit schema illustreert de SPLASH-workflow. Na toevoeging van gebiotinyleerd psoraal in de aanwezigheid van 0,01% digitonine en UV-crosslinking wordt het totale RNA uit de cellen geëxtraheerd en wordt er een dot blot uitgevoerd om te bevestigen dat de crosslinking efficiënt was. Gebiotinyleerde oligos van 20 basen worden vervolgens als positieve controles gebruikt om de hoeveelheid gebiotinyleerd psoraal die aan de cellen moet worden toegevoegd te titreren, zodanig dat ongeveer één op de 150 basen wordt gecrosslinkt.

Vervolgens wordt kleinschalige PCR-amplificatie uitgevoerd met een toenemend aantal PCR-cycli om het minimale aantal cycli te bepalen dat nodig is voor deep sequencing. In een efficiënt proces voor bibliotheekvoorbereiding kan een cDNA-sequencingbibliotheek worden geamplificeerd vanuit een input van 1,5 µg grootte-geselecteerd RNA in minder dan 15 cycli van PCR-amplificatie. De bibliotheek wordt vervolgens gesequenced met twee reads van 150 baseparen op een high-throughput sequencingmachine.

De sequencingreads worden vervolgens verwerkt volgens de computationele pijplijn. Het eindresultaat is een lijst met gefilterde chimere interacties, die zowel intramoleculaire als intermoleculaire RNA-RNA-interacties in het transcriptoom bevat. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te controleren op de incorporatie van gebiotinyleerd psoralen wanneer SPLASH wordt toegepast op nieuwe organismen.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de RNA-biologie om RNA-interacties in diverse organismen te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een sequencing-bibliotheek maakt die paarsgewijze RNA-interacties globaal in de cel vastlegt.