遅行本鎖DNA合成の動態インビトロバクテリオファージT7複製タンパク質によって

この手順の全体的な目標は、プライマーおよび遅延鎖DNA合成の動態を調べることです。この方法は、DNAプライマーゼによってプライマーがどのように形成され、DNAポリメラーゼに移行され、DNAポリメラーゼによって利用されるかなど、DNA複製分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、岡崎フラグメント合成中の主要なステップを同定できることです。

この実験では放射性物質を使用しているため、放射性物質の安全な使用と廃棄に関するすべての機関の規則に従う必要があります。まず、2マイクロリットルのホルムアミド染料バッファーを、分析する時点の数に等しい8本の1.5ミリリットルポリプロピレンチューブに分注します。次に、P32によりα−リン酸基に標識されたバッファー、ATP、CTP、CTP、一本鎖DNA鋳型、および遺伝子4タンパク質、またはGP4プライマーゼヘリカーゼからなる20マイクロリットルの混合物を調製する。

混合物を室温で5分間インキュベートします。5分後、ピペッターを使用して2マイクロリットルの混合物を取り出し、以前に調製した1.5ミリリットルのチューブの1つで2マイクロリットルのホルムアミド染料緩衝液と混合します。これが無反応制御です。

反応混合物に2マイクロリットルの0.1モル塩化マグネシウムを加え、すぐにタイマーを開始します。10秒間隔で、反応混合物の2マイクロリットルのサンプルを手動で引き出し、1.5ミリリットルのチューブでホルムアミド染料と混合します。すべての時点が収集されたら、サンプルをヒートブロック内で摂氏95度で5分間加熱します。

サンプルのアリコートを変性ゲルにロードして電気泳動します。この手順は、反応混合物を準備することから始めます。400マイクロリットルの溶液Aを含むバッファー、GP 4六量体、一本鎖DNAテンプレート、dNTP、ATP、CTP、およびP32でα-リン酸基に標識されたCTPを調製します。

1つのXバッファーと20ミリモルの塩化マグネシウムを含む400マイクロリットルの溶液Bを調製します。次に、急速急冷流装置をセットアップします。機器の電源を入れ、メインメニューが表示されたら、機器キーボードに7と入力して、シリンジドライバーをホームポジションに移動します。

ロードするバッファーシリンジの位置を開きます。シリンジCを急冷溶液で満たし、次に10ミリリットルのシリンジを使用して、器具のバッファーリザーバーAおよびBにバッファーを充填します。プランジャーを出し入れして気泡を取り除きます。

ノブの位置を変更して発射します。2を入力して、シリンジドライバーバーの位置を調整します。下調整ボタンを押して、バッファーが出口ループから出るまでシリンジを下げます。

escape と入力して、メインメニューに戻ります。チューブを洗浄するには、出口ラインを掃除機に取り付けます。サンプルノブをフラッシュに変更します。

ノブを水平位置にセットして、バッファーシリンジを閉じます。バキュームの電源を入れ、2つのフラッシュループを水に10秒間浸し、次にメタノールに10秒間浸します。ループを約15秒間、または乾くまで空気を吸い込んで乾かします。

サンプルをロードするには、サンプルノブの位置をロードに変更します。溶液Aを1ミリリットルのシリンジに入れ、シリンジをサンプルロードポートの1つに差し込み、同様に、溶液Bを反対側のサンプルロードポートに置きます。タイムポイントの収集を開始するには、メインメニューにタイムポイントを入力して、クエンチフローを実行します。

反応時間を入力し、Enterキーを押します。使用する反応ループ番号が表示されます。必要な反応ループに切り替えます。

前に示したようにチューブを洗浄した後、サンプルノブを回してロードします。反応混合物をサンプルループにロードし、中央のミキシングコンパートメントのすぐ外側まで入れます。すべてのノブを回して発射し、すべてのノブが正しい位置にあることを確認します。

出口ループの端に1.5ミリリットルのチューブを置きます。goを押してリアクションを実行します。チューブ洗浄手順を繰り返した後、バッファーシリンジAとBをバッファーシリンジドライバーに当たるまで再ロードします。

必要な各時点に対して反応を実行する手順を繰り返しますが、1つの例外として、ゼロ時間点制御を急冷するときに溶液Bをロードしないでください。サンプル収集が終了したら、escape と入力してメインメニューに戻ります。7を押して、バッファーシリンジドライバーをホームポジションに戻します。

反応混合物シリンジを取り外して機器のクリーンアップを開始し、サンプルローディングノブをロード位置に回します。真空下で、各サンプルループを水酸化ナトリウム、リン酸、メタノールをそれぞれ10ミリリットルで洗浄します。3つのシリンジプランジャーをすべて押し下げて、反応を回収し、バッファーをクエンチします。

シリンジを5ミリリットルの水で少なくとも2回洗ってください。シリンジに5ミリリットルの水を再度満たし、ノブを火の位置に回し、掃除機をオンにし、キーボードコマンドでドライバーを下げて水を取り除きます。前に示したようにチューブを洗浄します。

最後に、急速急冷フロー装置の電源を切ります。その後、サンプルはテキストプロトコルに記載されているように分析されます。これらの結果は、GP 4によって触媒されたプライマー合成反応を、複数のターンオーバー条件下で手動でサンプリングすることによって得られました。

標識された前駆体CTPは最も高い移動度を示し、ゲルの底部に向かって移動し、続いて、GP fourによって合成された色素およびテトラリボヌクレオチドに対応する、より遅い移動種が移動します。インキュベーションの長さとテンプレート配列のコンテキストに応じて、高位オリゴマーに対応する追加の標識産物を観察できます。GP 4によって触媒される反応を数msまでの時間スケールで急速クエンチ装置で調べると、プライマーの蓄積が線形ではなく、実線で示される二相性プロファイルを示すことは明らかです。

これは、生成物の形成が急速であり、定常状態では放出が律速であることを示唆しています。点線は、GP 4によるプライマー形成が事前定常状態バーストで進行しなかった場合に生じる仮想的な進行曲線を表しています。シングルターンオーバープライマー合成実験により、基質から生成物への変換中の中間種の形成と崩壊に関する情報が得られます。

四量体形成の時間経過は、ゲル画像によって示されます。グラフは、中間の形成と時間を示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば90分で完了します。

放射性試薬の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には常に適切なシールドなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。