Пептид Сканирование при содействии идентификации моноклональных антител узнаваемым Линейная B-клеточный эпитоп

Общая цель этого протокола заключается в идентификации линейного эпитопа В-клеток, распознаваемого моноклональными антителами, с использованием последовательно усеченных рекомбинантных белков и сканирования пептидов методом дот-блот-гибридизации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся взаимодействия молекул между антигеном и антителом. Основными преимуществами данной методики являются ее простота и эффективность.

Идентифицирующий эпитоп затем может быть использован в более полных исследованиях, таких как терапевтические и диагностические приложения. Демонстрировать процедуру будет Чен-Вэнь Чен, постдокторант моей лаборатории. Для начала выращивайте клетки моноклональной гибридомы мыши RGM56 в гибридной среде, свободной от сыворотки.

Выдерживайте клеточные культуры в колбах 175 Т при температуре 37 градусов Цельсия 5% углекислого газа. После пяти дней инкубации соберите питательную среду после того, как она станет желтой, и центрифугируйте надосадочную жидкость при 4500-кратном перегрузке в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Затем выбросьте гранулированный клеточный мусор, чтобы получить антитело в растворе.

Затем добавьте два миллилитра 50% белка G сельскохозяйственной суспензии в пятимиллилитровую колонку и уравновесьте смолу 10 миллилитрами ледяного PBS, что равно 10 объемам предварительно загруженной смолы. Загрузите 200 миллилитров приготовленного ранее раствора антитела в уравновешенную колонку и отбросьте фракцию, которая проходит через колонку. Используя 10 миллилитров ледяного PBS, промойте колонку дважды.

Наконец, чтобы удалить антитело из смолы, добавьте в колонку 10 миллилитров раствора миллимолярного глицерина при pH 2,7. Соберите 900 микролитровых фракций в микроцентрифужные пробирки, предварительно заполненные 100 микролитрами 10Х нейтрализующего буфера. Храните очищенное антитело в 50% растворе глицерина с добавлением азида натрия при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Подготовьте конструкции и преобразуйте клетки E.coli BL21, как описано в текстовом протоколе. Затем переложите одну колонию в 15-миллилитровую пробирку, содержащую три миллилитра LB-бульона, дополненного 100 микрограммами на миллилитр ампициллина, и неплотно закройте пробирку. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия при встряхивании со скоростью 150 об/мин.

Контролируйте оптическую плотность культуры на уровне 600 нанометров. Когда она достигнет примерно 0,6, охладите культуру до 25 градусов по Цельсию. Затем добавьте IPTG в конечной концентрации 0,4 миллимоляра, чтобы индуцировать экспрессию рекомбинантного белка.

Инкубируйте культуру еще четыре часа при температуре 25 градусов Цельсия и встряхивая со скоростью 200 об/мин. После инкубации переложите один миллилитр бактериальной культуры в микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте клетки при 12 000 G в течение одной минуты и выбросьте надосадочную жидкость.

Пипетируя вверх и вниз с помощью микропипетки, ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах денатурационного буфера. И перемешайте полученную суспензию путем энергичного вортексинга, чтобы получить готовый к использованию образец рекомбинантного белка. Чтобы приступить к дот-блот-гибридизации, растворите каждый синтетический пептид в ДМСО с получением 10 миллиграммов на миллилитр растворов.

Затем активируйте мембрану PVDF в метаноле на две минуты и уравновесьте ее модифицированным буфером Towbin еще на две минуты. Промойте лист хроматографической бумаги модифицированным буфером Towbin и положите на него уравновешенную мембрану PVDF. Дайте мембране постоять до тех пор, пока буфер не исчезнет с ее поверхности.

С помощью наконечника объемом 10 микролитров добавьте по два микролитра каждого образца пептида или рекомбинантного белка на мембрану и дайте ему высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Нанесение символа на мембрану является наиболее важным этапом в этом протоколе. Загрузка точного количества образца на небольшой участок мембраны из ПВДФ требует тщательного внимания.

Затем заблокируйте мембрану в буфере TBST с добавлением 5% обезжиренного молока на 30 минут при комнатной температуре с легким встряхиванием. Разведите моноклональное антитело RGM56 в буфере TBST с добавлением 5% обезжиренного молока. И добавьте раствор антитела на мембрану.

Инкубируйте мембрану при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, слегка встряхивая. После инкубации удалите раствор антител. И дважды промойте мембрану в буфере TBST в течение пяти минут с легким встряхиванием.

Затем добавьте к мембране раствор вторичного антитела, разведенный в буфере TBST с 5% обезжиренным молоком. Выдерживайте мембрану в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия с легким встряхиванием. После инкубации выбросьте раствор антител и промойте мембрану в буфере TBST дважды в течение пяти минут, осторожно встряхивая.

Затем обработайте мембрану раствором субстрата при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте. При появлении сигнала следует остановить реакцию, промыв мембрану дважды дистиллированной водой. После сушки мембраны на воздухе сделайте дот-блоттинг с помощью системы визуализации.

Наконец, с помощью программного обеспечения для анализа изображений измерьте интенсивность каждой точки-блота. Здесь представлен полноразмерный белок кода вируса некроза нервов, содержащий аминокислоты от 1 до 338, а также его последовательно усеченные варианты. Для подтверждения экспрессии белков в трансформированных бактериальных клетках был проведен дот-блот-анализ с использованием антител анти-6XHis, показывающий наличие всех исследуемых белков.

Затем рекомбинантные белки были проанализированы методом дот-блот-гибридизации, в которой использовалось моноклональное антитело RG-M56. Анализ показал, что эпитоп белка, распознаваемый антителом, находится в пептиде от 195 до 338. Наконец, эпитоп, состоящий из 20 или восьми аминокислотных остатков, был идентифицирован с помощью пептидного сканирования.

Сканирование аланина показало, что замены остатков валина в положениях 197 и 199, а также цистина в положении 201 отменяют связывающую способность эпитопа и гибридизацию методом дот-блот. Аналогичным образом, снижение аффинности связывания наблюдалось при анализе интенсивности связывания, подтверждающем, что идентифицированные остатки имеют существенное значение для связывания эпитопа с моноклональным антителом RGM56. Этот метод идентификации пептидов может быть использован для разработки терапевтических пептидных препаратов или пептидных препаратов.