用于研究小鼠视网膜循环中流动动力学的红细胞和白细胞的荧光染料标记

该程序的总体目标是使用扫描激光检眼镜可视化小鼠血细胞的视网膜循环。这种方法可以帮助回答有关视网膜疾病的关键问题，例如 WBC 和 RBC 的视网膜底部动力学是什么，以及它们的流动动力学如何促进疾病发病机制。该技术的主要优点是它可以反映不同的疾病表型，并且也非常易于执行。

我们的团队成员 Praveen、Bo Bo 和 Neha 将演示此程序。分离小鼠血细胞层：将新鲜采集的全血层放在 2 毫升管中的 1：1 多聚蔗糖和钠泛影溶液上。然后将试管离心 30 分钟。

接下来吸出并丢弃血浆上清液。然后小心地将白细胞组成的血沉棕黄层和红细胞的底层收集在单独的试管中。接下来用 1XPBS 洗涤红细胞以去除任何污染物，并将它们重悬于一体积的 PBS 中。

然后将半毫升等分试样的悬浮液转移到微量离心管中。旋转等分试样，弃去上清液，向沉淀的红细胞中加入约 200 微升 40%1XPBS。将它们混合均匀。

并在室温下孵育 5 分钟。5 分钟后，向每个悬浮液中加入 100 μL ICG。使用倒置混合试管，然后在室温下孵育 5 分钟。

接下来加入 300 微升 1XPBS，并在 37 摄氏度下轻轻搅拌孵育一小时。然后离心悬浮液，保留沉淀的细胞并将它们重悬于一毫升 1XPBS 中。继续用 1XPBS 洗涤细胞，直到上清液澄清。

倾析后，将上清液加回一体积的 1% BSA 和 PBS，以达到 ICG 标记的红细胞的 50% 血细胞比容。接下来处理血沉棕黄层集合。首先用 10 ml 1XPBS 洗涤细胞一次，以去除任何污染物。

再次离心样品，然后将沉淀重悬于 900 微升 1XPBS 中。接下来加入 100 μL 10% 荧光素钠，并在室温下孵育细胞 2 分钟。最后，用 10 毫升 1XPBS 洗涤标记的淋巴细胞 3 次。

离心并重悬于 100 微升 1XPBS 中。要制备用于注射的 ICG 标记的红细胞，首先将注射用等分试样稀释至 5% 或 1% 的血细胞比容。麻醉小鼠并放大其瞳孔。

然后在双眼上涂抹眼药膏。并将隐形眼镜放在其中一只眼睛上。现在使用带有 25 屈光度正透镜的共聚焦 SLO 相机对鼠标进行成像，以补偿眼睛的屈光。

Fresh 完美地将角膜引导到 SLO 机器的光学头。接下来，打开成像模块并对其进行作，直到视神经位于成像屏幕的中心。然后以 30 度角拍摄红外眼底图像。

接下来拍摄红外眼底视频。打开 790 纳米 ICG 滤镜，将相机模式设置为高速添加，保持视角在 15 到 30 度。然后将所有读数的 ICG 强度设置为 85。

在控制面板上，单击获取按钮以每秒 8.8 到 15 帧的速度拍摄基准视频一分钟。接下来，用 30 号针头将 100 微升 ICG 标记的红细胞装入胰岛素注射器中，然后将细胞注射到尾静脉或眶后注射。注射后，立即拍摄新的红外眼底图像和新的 ICG 滤光片视频。

获取视频后，将其导出为 TIFF 格式以进行图像分析。使用免费提供的成像软件包 MHJ 处理图像。打开文件后，设置图像视频的帧间隔以进行速度测量。

然后打开 MtrackJ 插件。从菜单中选择 tracking 并切换在添加点后移动到下一个时间帧索引的选项。现在找到感兴趣的单元格并跟踪每个帧。

从菜单中，单击 添加 添加新轨道，然后单击所选单元格。然后，随着图像从一个帧移动到另一个帧，继续单击单元格的当前位置。跟踪后，从显示选项中更改轨迹的显示选项，并选择仅显示当前时间的跟踪点。

继续单击直到显示单元格的轨迹，然后保存轨迹。现在继续跟踪下一个单元格，从 add 命令开始，并像跟踪第一个单元格一样。跟踪所有感兴趣的单元格后，使用 measure 选项打开所有跟踪测量值的显示。

然后保存输出以供进一步分析。使用 1% 或 5% 血细胞比容在 C57 黑色 6J 小鼠的视网膜循环中可视化用 1.5% ICG 标记的红细胞，细胞是可区分的，但在 1% 血细胞比容中，标记的细胞更容易可视化。在任一注射浓度下，在旁区域都可以观察到一些红肿，并且在 5% 血细胞比容下更明显。

用 1% 荧光素钠标记白细胞，并使用荧光显微镜观察为绿色标记的细胞。观察到一些结块。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在六个小时内完成。

在尝试此过程时，重要的是要散瞳眼睛以获得高质量的视网膜图像和视频。