WinCFモデル - 肺感染症の微生物学を研究するための粘液で閉鎖された細気管支の安価で収縮可能なマイクロコスモス

この手順の全体的な目標は、肺の環境を模倣し、病原体が病気を引き起こすのとより類似した方法で病原体を成長させることです。この方法は、嚢胞性線維症の肺で多様な細菌性病原体がどのように相互作用するかなど、気道微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、実験条件を簡単に操作できることです。

実際の肺気管支で発生するのと同様の微生物応答を観察すること。その手順を実演するのは、当研究室のWill Comstockです。人工痰培地を調製するには、以前に調製した粘液原液16ミリリットル、塩化カリウム原液2ミリリットル、塩化ナトリウム原液2ミリリットル、卵黄エマルジョン200マイクロリットル、DNA原液5.6ミリリットル、フェリチン原液120マイクロリットル、必須アミノ酸溶液5.78ミリリットル、非必須アミノ酸溶液5.78ミリリットルを組み合わせます。 2.44ミリリットルの滅菌水。

無菌の人工痰培地を慎重に作成することは非常に重要です。汚染は、インキュベートされたキャピラリーチューブ内の細菌活性を変化させる可能性があるため、さらにラインを下回ることができます。穏やかに振とうして混合した後、5ミリリットルの培地を8本の滅菌15ミリリットル遠心分離チューブにピペットで移します。

これで、媒体を所望の化学的条件を達成するために改変することができます。たとえば、ここに示されている媒体は、PHが変更され、異なる酸性度を反映するために色素が追加されています。次に、滅菌バイオフードの下に、8本の滅菌1.5ミリリットル微量遠心チューブのそれぞれに900マイクロリットルの培地を追加します。

以前に取得した喀痰サンプルを均質化するには、3ミリリットルのシリンジを使用して、喀痰が滑らかな粘稠度になるまで繰り返し引き出したり排出したりします。均質化された喀痰を100マイクロリットルを8本の微量遠心チューブのそれぞれに加えます。次に、チューブをボルテックスして十分に混合します。

以前に調製した培地の微量遠心チューブに従って、さらに8本の滅菌15ミリリットル遠心分離チューブにラベルを付けます。これらがインキュベーションチューブになります。70%エタノール溶液を使用してペーパータオルを滅菌し、乾かします。

タオルをそれぞれ約4平方インチに引き裂きます。次に、各インキュベーションチューブの底に1つずつ砕きます。各インキュベーションチューブの底に紙の塊を1つ置いて、1ミリリットルの滅菌水を使用して各塊をわずかに湿らせ、チューブ内に湿った環境を作り出します。

メディウムの各チューブについて、チューブの一方の端をメディウムに保持し、水平に傾けることにより、3つのガラスキャピラリーチューブにメディウムを充填します。毛細管現象により、媒体をチューブに導きます。手袋をはめた指をチューブの開いた端にそっと置いて充填を停止し、次にチューブのもう一方の端をキャピラリーパテシーラントのブロックに押し下げてシールします。

3本のキャピラリーチューブの各セットを、パテシール面を下にして15ミリリットルのインキュベーションチューブに入れます。次に、チューブにキャップをして、ラベルが貼られていることを確認します。この3本のキャピラリーチューブは、各制御条件を再現するためのものです。

すべてのインキュベーションチューブが指定されたキャピラリーチューブで満たされたとき。ラックを摂氏37度に置き、チューブが水平にインキュベートされるようにして、発生したガスが開放端から逃げないようにします。チューブを48時間インキュベートします。

インキュベーターからチューブを取り外し、水平に保つようにします。インキュベーションチューブからキャピラリーチューブを慎重に取り出し、各3セットを他のセットから分離します。キャピラリーチューブをライトボックスに並べて配置し、チューブの内容物が下から見えて照ら

3本のチューブごとに隙間を縫って、異なる化学的条件を分離します 次に、すべてのチューブが視野内で見えるように、カメラの真上のチューブにカメラを合わせ、ライトボックスからの光がチューブ染料の色の十分なコントラストと視覚化を提供します。下流の分析のためにチューブの内容物を抽出するには、ライトボックスから一度に1セットの三重毛細血管を取り外します。25ゲージの0.5インチの鈍い端の針をキャピラリーチューブの詰まった端に挿入して、シールを破ります。

次に、キャピラリーチューブを逆さまにして、媒体が上部から1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに滴下できるようにします。培地が滴り落ちない場合は、200マイクロリットルのピペットを使用して、キャピラリーチューブの端に挿入されたときにピペットプランジャーを押し下げて、培地をチューブから排出します。ここに示すように、培地に喀痰サンプルを添加しなかった場合、インキュベーションの 48 時間後に pH スペクトル全体で示された変化は、わずかな蒸発による培地容量のわずかな減少だけでした。

接種された毛細血管チューブは、体積の変化、気泡の出現、色の変化、および不透明な沈着物の出現を示しました。これらの結果は、添加された痰に含まれる細菌やその他の微生物が、人工培地内で増殖し、変化する可能性があることを示しています。インキュベーション後、メタボロミクスやDNAシーケンシングなどの他の方法を実行して、毛細管内で増殖する微生物の挙動に関する追加の質問に答えることができます。

winCFシステムは、肺マイクロバイオームの活動を研究するための新しい方法です。CF、COPD、喘息など、多くの疾患にとって重要です。