Name: Een methode voor de productie van recombinante eiwitten mCD1d in insectencellen. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer de productie van recombinante mCD1d-eiwitten in insectencellen met behulp van baculovirusinfectie. Deze methode genereert tetrameren voor NKT-celherkenning in immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

I. Ontdooi de Cellen Neem de bevroren flacon Tn5 cellen, en ontdooi het in een 37 ° C waterbad. Voeg 5 ml insect Express medium (Invitrogen, catalogus nummer 10486) in 25cm 2 TC kolf. Merk op dat Express vijf komt zonder glutamine, moet 10 ml van de 100X glutamine pen strep of Glutamine alleen om een ​​lt media toe te voegen. Voeg Tn5 cellen erin en incubeer gedurende 30 minuten in een 27 ° C incubator. Dan, het medium Zuig voorzichtig met DMSO zonder verstoring van de cellen aan de onderkant van de kolf. Voeg 5 ml vers medium. II. Groeien en uitbreiden van de Cellen Monitor de cellen elke dag. Wanneer fles is bijna 70% confluent, breng de cellen in suspensie door bonzen de kolf aan beide zijden en de overdracht van de cellen naar 175cm 2 kolf door toevoeging van 21 ml van insecten te drukken medium en 5 ml van celkweek. Elke T175 fles moet ongeveer 25-30ml medium als een eindvolume. Split confluerende kolf (ca. 1 miljoen / ml conc.) 1 / 4 of 1 / 5 als dat nodig is. Laat geen cellen overwoekeren. Tel het aantal passages dat u de cellen gesplitst. Groeien niet meer dan doorgang nummer 30, omdat het kan leiden tot veroudering van de cellen als gevolg cellysis. Wanneer u het gewenste volume te bereiken bij een concentratie van 1 miljoen / ml, infecteren de cellen. Ik heb over het algemeen groeien 2 tot 2,5 liter, die meestal neerkomt op zeventig 175cm 2 flessen en ca.. 25 tot 30 ml / kolf, of vijf 1 liter erlenmeyers en ca.. 400ml tot 500 ml in elke kolf Let op: je kunt als cellen groeien in T-175 plug seal fles of Corning erlenmeyer. Groeiende cellen in erlenmeyers is sneller en gemakkelijker. III. Titering het virus door Eindpunt verdunningsmethode <ol><li> Plaat 3000-5000 cellen per putje in vlakke bodem 96 wells-plaat in 200ul van Express vijf SFM medium. Laat de cellen af ​​te wikkelen bij 27 ° C gedurende ten minste 30 minuten. </li><li> Maak seriële verdunning van baculovirus voorraad. Men zou moeten doen 1 / 10 verdunning in een lijn van 96 en U-bodemplaat, met behulp van 250ul per well. Verdunningen worden gemaakt in Express Vijf SFM medium. </li><li> Met behulp van een multichannel pipet een vast bedrag (meestal 20 ul) van verschillende verdunningen aan de cellen. </li><li> Cultuur bij 27 ° C gedurende 7 dagen. Om te voorkomen dat de verdamping van de rand rijen, wikkel de randen van de plaat met parafilm. </li><li> Na 7 dagen, controleer dan de plaat en bepalen welke verdunning van het virus geeft een 50% infectie - de helft van de putten op dit virus besmet zijn concentratie). Maak dan gebruik van een formule om de titer, die wordt uitgedrukt in pfu / ml (PFU-plaque-vormende eenheden) te berekenen. De formule is gevonden in de meeste baculovirus handleidingen. </li></ol> IV. Het infecteren van de cellen Het is zeer belangrijk te weten wat de exacte titer van het virus. Voeg benodigde hoeveelheid virus. Voor virale stofvoorbereiding de cellen moet worden geïnfecteerd bij multipliciteit van infectie (MOI) van niet meer dan een (1pfu tot vijf cel 1High) Hoger MOI leidt tot de productie van virale mutaties. Voor eiwitproductie, gebruikelijke hoeveelheid is MO1 5-10. Voorbeeld: De titer van mCD1d baculovirus = 1X108 pfu / ml Voeg MOI = 1 (het virus te versterken) = 20x10 ^ 6 cellen / fles / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 ul / fles MOI = 5 tot 10 (voor eiwitproductie) = 1 ml tot 2 ml Voor 20x10 ^ 6 cellen / fles Op dag 4 na infectie, kijk naar de geïnfecteerde cellen. Zij moeten worden losgemaakt, drijvende, gezwollen en de vorming van worsten. V. herstellen Supernatanten Neem het medium van geïnfecteerde flessen, en transfer naar 250ml blauwe pet Falcon Spinning flessen. Ze kunnen autoclaaf worden gesteriliseerd en hergebruikt. Gelijkmatig vullen van de flessen en de centrifuge van de cellen in Sorvall GSA rotor bij max. 200 omw, 20 minuten, 4 ° C. Verzamel de supernatant en ga voor verdere zuivering. VI. Zuivering van Recombinant mCD1d <ol><li> Dialyse en concentratie in 150mm natriumfosfaatbuffer (pH 7,4) </li><li> Door de Ni-NTA Agarose Chromatografie, elueren het eiwit mCD1d + B2M met 150mm Natriumfosfaat +200 mm Immidazole </li><li> Run Ontzouten kolom met 20mm Tris-HCl-buffer pH8 om zich te ontdoen van Immidazole </li><li> Run anionuitwisselingschromatografie met behulp van MonoQ kolom om de resterende verontreinigingen te verwijderen. </li><li> Concentreren om 1mg/ml met behulp van YM 30 concentrator (Millipore) </li><li> BirA enzymatische biotynlation van mCD1d volgens protocol van de fabrikant (aviditeit) </li><li> De vrije biotine wordt uitgescheiden via de S200 kolom (size exclusion Chromatograpy) met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4. Een gemiddelde van 2 tot 3 mgs van biotynlated eiwit kunnen worden verkregen uit 2 liter van het supernatans </li><li> Productie van een-Galcer CD1d tetrameer. </li></ol> Met het oog op CD1d molecuul belasting met een-Galcer, oplosbaar biotynlated CD1d-b2m is gedurende de nacht geïncubeerd bij kamertemperatuur met drie voudige molaire overmaat van een-Galcer, opgelost in 0,5% Tween -20 in PBS, O.9% natriumchloride. Tetrameren worden gegenereerd door het mengen van een-Galcer beladen CD1d monomeren met 4-voudige molaire overmaat van PE - geconjugeerd streptavidine en incuberen gedurende 4 uur bij kamertemperatuur. Bewaren bij 48 ° C.

<ol><li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).</li>
<li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> Nature. 434, 520-525 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).</li>
<li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+family%3A+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).</li>
<li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+tetramers%3A+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).</li>
</ol>

In deze procedure wordt aangetoond hoe te starten, groeien, infecteren cellen Insect en hoe u het baculovirus het gebruik van deze cellen titer. De belangrijkste aspecten van deze procedure is het onderhoud van cellen en om de exacte titer van baculovirus kennen. Als je eenmaal hebt CD1 tetrameren gegenereerd, kunnen ze worden gebruikt als een krachtig instrument voor de analyse van glycolipide reactieve T-cellen. Baculovirus systemen worden ook veel gebruikt voor recombinante eiwitten, met inbegrip van MHC klasse II tetrameren dus deze pro...

<table><tbody><tr><td>Express Five SFM</td><td>Serumvrij medium</td><td>Invitrogen</td><td>10486025</td><td></td></tr><tr><td>High Five TM</td><td>Insectencellen</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine Pen strep</td><td>Antibiotica</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 TC-fles</td><td>Kunststof</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 TC-fles</td><td>Fles met stopafdichting</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-8</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolf</td><td>Celkweekkolf</td><td>Fisher Scientific</td><td>07 200 672</td><td></td></tr><tr><td>YM 30 Concentrator</td><td>30.000 MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC 903096</td><td></td></tr><tr><td>FPLC-apparatuur</td><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BrA-enzym en buffer</td><td>Biotinyleringskit</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose-kolom</td><td>Zuiveringskolom voor His-tag eiwitten</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ontzoutingskolom</td><td>Voor het verwijderen van zout uit eiwitten</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoQ-kolom</td><td>Anionenuitwisselingschromatografie</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200-kolom</td><td>Size-exclusion chromatografie</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alpha-Galcer</td><td>Glycolipide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-Streptavidine</td><td>Voor eiwitconjugatie</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S-866</td><td></td></tr></tbody></table>

een methode voor de productie van recombinante eiwitten mcd1d in insectencellen.

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 eiwitten vormen een derde klasse van antigeen-presenterende moleculen. Ze zijn celoppervlak glycoproteïnen, uitgedrukt als ongeveer 50-kDa geglycosyleerd zware ketens die niet-covalent geassocieerd zijn met beta2-microglobuline. Ze binden lipiden in plaats van peptiden. Hoewel de structuur bevestigt de gelijkenis van CD1 eiwitten MHC klasse I en klasse II antigeen presenterende moleculen, de mCD1d groef is relatief smal, diep en zeer hydrofoob en heeft twee bindende zakken in plaats van de verschillende ondiepe zakken beschreven voor de klassieke MHC- gecodeerde antigen-presenterende moleculen. Op basis van hun aminozuursequenties, zoals een hydrobphobic groef biedt een ideale omgeving voor de binding van lipide antigenen. De Natural Killer T (NKT) cellen gebruiken hun TCR om glycolipids gebonden aan of door CD1d herkennen. T-cellen reactief naar lipiden gepresenteerd door CD1 betrokken zijn geweest bij de bescherming tegen auto-immuun-en infectieziekten en in tumor afwijzing. Zo, de mogelijkheid om te identificeren, te zuiveren en volgen de reactie van CD1-reactieve NKT cel is van groot belang. Het genereren van tetrameren van alpha galactosyl ceramide (een-Galcer) met CD1d heeft belangrijke inzicht in de biologie van NKT cellen. Tetrameren opgebouwd uit andere CD1 moleculen zijn ook gegenereerd en deze nieuwe reagentia zijn sterk uitgebreid de kennis van de functies van lipide-reactieve T-cellen, met potentieel gebruik bij het toezicht op de respons op lipide-gebaseerde vaccins en in de diagnose van auto-immuunziekten en andere behandelingen.

Een methode om Insectencellen voor te bereiden en te infecteren ze met baculovirus voor het doel van de productie van recombinante mCD1d proteinand het genereren van mCD1d tetrameren.

Een methode voor de productie van recombinante eiwitten mCD1d in insectencellen.

CD1-eiwitten vormen een derde klasse van antigeenpresenterende moleculen. Het zijn celoppervlakte-glycoproteïnen, die tot expressie komen als geglycosyleerde eiwitten van ongeveer 50 kDa ...

Hallo, ik ben Ashra Corona van het laboratorium van Dr. Mitch Kronenberg van de afdeling Ontwikkelingsimmunologie aan het La Jolla Institute for Allergy and Immunology. Vandaag ga ik u laten zien hoe u High Five-insectencellen prepareert en deze infecteert met VIR met als doel MA CD 1D-tetrameren te genereren. CD 1D-tetrameren worden door ons laboratorium en door anderen gebruikt voor de herkenning van NKT-cellen.VIR-systemen worden op grote schaal gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten, waaronder MS C-klasse twee TE-tremoren. De procedure die u getoond zal worden, heeft daarom een veel bredere toepasbaarheid. Deze procedure omvat het initiëren en opkweken van High Five insectencellen, het infecteren van de cellen met een reovirus dat CD 1D cDNA draagt, het oogsten van het supernatant door centrifugatie na vier dagen infectie, lyse en concentratie van het eiwit in 150 millimeter natriumfosfaatbuffer, pH 7.4, zuivering van het muis CD 1D-eiwit met Ni-NTA-agarose en ionenuitwisselingschromatografie, concentratie van het muis CD 1D-eiwit tot 1 mg/mL met een YM 30-concentrator, enzymatische validatie van muis CD 1D via het AVID D-protocol en eliminatie van vrij biotinylaa

a-method-for-production-of-recombinant-mcd1d-protein-in-insect-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Kindlins fundamenteel celadhesie door integrines maar studies ervan werden gehinderd door de moeilijkheid erin recombinante expressie in bacteriële gastheren. We beschrijven hier werkwijzen voor de efficiënte productie in baculovirus-geïnfecteerde insectencellen.

Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Wij rapporteren met behulp van een kunstmatige intronic kleine RNA expressie strategie te ontwikkelen van een niet-defecte recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo uitvoeringssysteem. Een gedetailleerde procedure voor de bouw, de verpakking en de kwantitatieve analyse van de rAaeDV vectoren evenals wat larvale infectie wordt beschreven.

Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven

Dit protocol beschrijft een warmte schok-geïnduceerde proteïne expressie systeem (pDHsp/V5-zijne/sf9 cel), die kan worden gebruikt voor het uitdrukken van vreemde proteïnen of evaluatie van de anti-apoptotic activiteit van potentiële buitenlandse eiwitten en hun afgeknotte amino zuren in insect cellen.

Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay

Hier presenteren we een protocol om te produceren huis vliegen carboxylesterase eiwitten in vitro met een baculovirus gemedieerde insect cel expressie systeem en later functioneel karakteriseren van hun rollen in metaboliseringssysteem permethrin, daarmee overdracht van pyrethroïde weerstand door het uitvoeren van cel-gebaseerde MTT assay en in vitro metabole studies.

Functionele karakterisering van Carboxylesterases in Insecticide resistente huis vliegt, Musca Domestica

Hier presenteren we de protocollen voor het gebruik van het insect cel en baculovirus eiwit expressie systeem voor de productie van grote hoeveelheden uitgescheiden eiwithoudende gewassen voor eiwit kristallisatie. Een vector baculovirus expressie is gewijzigd met GP67 of insect hemolin signaal peptide voor plant secretie eiwituitdrukking in insect cellen.

Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden

Het baculovirus expressie vectorsysteem (BEVS) is een robuust platform voor expressiescreening en productie van eiwit arginine methyltransferases (PRMT's) voor biochemische, biofysische en structurele studies. Milligram hoeveelheden materiaal kunnen worden geproduceerd voor de meerderheid van PRMT's en andere eiwitten van belang die een eukaryotische expressie platform vereisen.

Productie van recombinante PRMT-eiwitten met behulp van het Baculovirus Expression Vector System

Leer de productie van recombinante mCD1d-eiwitten in insectencellen met behulp van baculovirusinfectie. Deze methode genereert tetrameren voor NKT-celherkenning in immunologisch onderzoek.

Een methode voor de productie van recombinante eiwitten mCD1d in insectencellen.

Meer video's verkennen