Aprovação do DNA Dye-desencadeada fenótipo de população lateral para detectar e purificar células-tronco de câncer de amostras biológicas

O objetivo geral deste procedimento é detectar populações de células-tronco cancerígenas putativas em amostras biológicas com base na capacidade de extrusão de corante das células da população lateral. Este método aborda uma questão-chave na pesquisa com células-tronco cancerígenas sobre meios confiáveis para detecção e purificação de células-tronco cancerígenas de amostras biológicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela implanta marcadores funcionais e, portanto, fornece melhor resolução.

Além disso, a expressão desses transportadores de drogas ABC é altamente conservada entre as células-tronco cancerígenas e, portanto, podemos usar essa técnica para muitas entidades cancerígenas diferentes. As implicações dessa técnica se estendem à descoberta de terapias com células-tronco anticancerígenas porque facilitam a análise a jusante, como perfil de expressão gênica e validação de alvos em células cancerígenas altamente purificadas. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre as características das células-tronco cancerígenas.

Também podemos usar este método para caracterizar como um sistema que compreende o transportador de drogas ABC expressando populações como a medula óssea. Demonstrando o procedimento estará Elisabeth Hoflehner, uma técnica do meu laboratório. Para começar, cultive a linhagem de células cancerígenas humanas desejada a 37 graus Celsius em 10 a 30 mililitros de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, L-glutamina de dois milímetros e antibióticos.

Quando as células atingirem aproximadamente 70 a 90% de confluência, remova o meio e adicione dois mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA para separar as células da superfície da placa de cultura. Em seguida, lave as células com 10 mililitros de meio de cultura, transfira a suspensão para um tubo limpo de 15 mililitros e gire-o a 250 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Uma vez que as células são peletizadas, descarte o suprenante e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio de cultura.

Misture uma pequena alíquota da suspensão celular com solução de azul de tripano e conte as células usando um hemocitômetro. Para preparar as amostras de ensaio, suspender as células em meio de cultura fresco para obter uma suspensão celular de uma vez dez elevado a seis células por mililitro. Depois de ajustar a densidade da célula, transfira três mililitros da amostra para um tubo inferior redondo de 15 mililitros rotulado como teste.

Em seguida, adicione 10 micromolares de corante violeta à amostra e subtraia suavemente a suspensão. Em seguida, prepare os controles de inibição transferindo 500 microlitros do corante contendo suspensão celular para dois tubos de citometria de fluxo rotulados como controle. Adicione 50 micromolares de Verapamil ao primeiro.

E 20 micromolares de Fumitremorgin C para o segundo tubo. E misture as soluções pipetando suavemente. Cubra todos os tubos com tampas e incube-os a 37 graus Celsius no escuro por 90 minutos.

Agite suavemente as amostras a cada 15 minutos. Assim que a coloração estiver concluída, lave os controles de inibição em três a quatro mililitros de PBS gelado. E prepare alíquotas da amostra de teste para posterior coloração com anticorpos.

Lave também essas alíquotas e filtre todas as amostras através de filtros de corte de 70 mícrons para remover possíveis agregados celulares. Em seguida, centrifugue as suspensões a 250 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois de ressuspender o pellet resultante em 100 microlitros de PBS, mantenha as células no gelo protegidas da luz.

Em seguida, adicione um painel apropriado de anticorpos conjugados com flurocromo às células pré-fabricadas com corante violeta. Vortex as suspensões e incube-as a quatro graus Celsius no escuro por 20 a 30 minutos. Após a incubação, lave as células em três a quatro mililitros de PBS gelado, filtre a amostra, se desejar.

E então centrifugue a 250 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células peletizadas em 100 microlitros de PBS. Finalmente, adicione 7-AAD às células prestadas com corante violeta.

E incube as amostras por cinco a 10 minutos no escuro. Para analisar as células usando o citômetro de fluxo, coloque uma população de células apropriada em um gráfico de pontos FSC SSC. Em seguida, usando diferentes sinais FSC, exclua da população selecionada todos os agregados celulares.

Exclua as células que revelem coloração positiva de 7-AAD para obter a população de células viáveis. Para criar um gráfico de pontos para a emissão de corante azul e vermelho, exiba o canal fluorescente azul no eixo y e o canal fluorescente vermelho no eixo x. Mude ambos os canais para o modo linear e ajuste a tensão do detector de acordo para que a população lateral esteja localizada na parte inferior esquerda do gráfico.

Em seguida, bloqueie a população lateral. E pare a aquisição. Em seguida, carregue os controles de inibição e adquira os dados.

Por fim, crie um gráfico de pontos exibindo a florescência vermelha do corante violeta no eixo x e um canal de florescência apropriado no eixo y plotado no modo logarítmico. Carregue a amostra, ajuste as tensões do detector de acordo e identifique a facção das células da população lateral que expressam a superfície investigada. Em seguida, registre os dados.

Aqui são apresentados os resultados representativos da análise da população lateral realizada em células de câncer de ovário humano. A população lateral distinguida pela análise de emissão azul e vermelho-violeta foi identificada no quadrante inferior esquerdo do dot plot e constituiu 0,70% de toda a população analisada. O uso posterior de inibidores de efluxo resultou no desaparecimento do sinal de florescência observado para as células previamente identificadas, confirmando seu fenótipo de população lateral.

Finalmente, as células ovarianas humanas também foram caracterizadas em termos de expressão de ABCG2. A coloração positiva para ABCG2 foi observada em 0,67% das células correspondentes à população lateral identificada. Uma vez dominado, esse procedimento pode ser feito em aproximadamente duas a três horas, se executado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o fenótipo da população lateral depende estritamente de uma concentração ideal de corante para a proporção de densidade celular. A hidratação de ambas as variáveis é, portanto, altamente recomendada antes do experimento. Após este procedimento, outros métodos, como o perfil de expressão gênica, podem ser realizados para caracterizar ainda mais as células da população lateral, identificando novos alvos específicos de células-tronco cancerígenas para o desenvolvimento futuro de medicamentos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia de células-tronco explorarem as características das células-tronco teciduais e células-tronco cancerígenas, tanto em camundongos quanto em homens. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar a população secundária SA desencadeada por corante violeta e como detectar células-tronco cancerígenas putativas em amostras biológicas em seu próprio laboratório. Não se esqueça de que trabalhar com amostras biológicas pode ser extremamente perigoso e que precauções como o uso de EPI e cabines de segurança biológica devem ser tomadas ao trabalhar com este procedimento.