Name: 골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 학습하세요 뇌 조직의 Golgi-Cox 염색법을 통해 해마 신경세포의 수지상 돌기 복잡성을 평가하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구에서 신경 구조를 정밀하게 분석하는 데 필수적인 도구입니다.

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이 연구는 NIH P20 GM109005 (ARA) 및 Translational Neuroscience IDeA 프로그램 상 P30 GM110702 센터의 파일럿 보조금에 의해 지원되었습니다.

실험은 UAMS 기관 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인 한 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. 1. 동물과 5-Fu 주사 패러다임 <ol><li> 6 개월 된 수컷 C57Bl6 / J 야생형 마우스를 구입하여 1 살이 될 때까지 일정한 12 시간의 명암주기하에 보관하십시오. </li><li> 0.9 % 살균 식염수로 5 푸를 희석하십시오. 마우스 당 필요한 용량으로 60 mg / kg을 사용하십시오. </li><li> 5-Fu의 복강 내 주사를 주십시오 (3 주 동안 1 주일에 한 번). <ol><li> 매일 같은 시간에 복강 내 주사를합니다. 예를 들어, 0900-1200 시간. </li></ol></li><li> 동물을 안락사시키고 마지막 주입 후 30 일 동안 두뇌를 추출하십시오. </li></ol> 2. 안락사 절차 및 뇌 추출 <ol><li> 설치류를 억제하고 꼬리의 바닥을 잡아. 다른 한편으로, 엄지 또는 첫 번째 손가락을 th설치류 목의 바닥. 설치류의 목에 신속하게 압력을 가하고 꼬리를 잡고있는 다른 손이 뒤로 당기는 동안 앞으로 밉니다. </li><li> 한 손으로 설치류를 잡고 다른 한 손으로 대형 수술 가위를 잡으십시오. 두 블레이드 사이에 설치류의 목을 놓고 신속하게 머리를 참견하십시오. </li><li> 절단 된 마우스 헤드를 가져 와서 눈 위까지 두개골 위의 털을 다듬을 때 미세 가위를 사용하십시오. 그런 다음 가위 끝을 각 아이 소켓에 넣고 약간의 힘으로 가위를 닫으십시오. </li><li> 소용돌이를 사용하여 두개골을 소뇌의 좌우로 자른다. </li><li> 포셉을 사용하여 소뇌를 둘러싼 두개골 부분을 직접 들어 올리거나 떼어냅니다. </li><li> 두개골의 midsagittal 라인을 따라 잘라 봄 가위를 사용하십시오. </li><li> 포셉을 사용하여 두개골의 나머지 부분을 두뇌에서 들어 올리십시오. </li><li> 주걱과 프로브를 사용하여 두뇌를 원하는 용기에 넣으십시오. 스테인리스 사용teel 블레이드, midsagittal 비행기를 따라 각 뇌를 잘라. 오른쪽 반구에 다음 Golgi-Cox 방법을 수행합니다. </li></ol> 3. Golgi 염색 및 조직 준비 <ol><li> 갓 수확 한 반뇌를 10 mL 원뿔 튜브에 5 mL 염화 수은 기반 용액 (키트의 용액 A)에 담그십시오. 염화 수은 용액은 빛에 민감합니다. 호일로 튜브를 덮으십시오. 샘플을 실온에서 어둡게 보관하십시오. 참고 : 솔루션 A는 표에 나와있는 키트로 제공됩니다. 주의! 용액 A (염화 수은 용액이라고도 함)에는 중크롬산 칼륨, 염화 수은 및 크롬산 칼륨과 같은 독성 시약이 포함되어 있습니다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오. </li><li> 1 일 후, 용액을 일시적인 용기 (예 : 대형 계량 보트)에 천천히 방울을 옮겨 생물학적 유해 폐기물 용기에 버리십시오. 두뇌 (원래 10 ML 원뿔 튜브에 여전히) 5 ML과염화 수은 용액에 넣고 샘플을 실온에서 13 일 더 어두운 곳으로 되돌립니다. </li><li> 증류수 또는 탈 이온수 (dH 2 O) 90 mL에 30 g의 함침 완충액을 넣는다. 6 잘 접시의 각 우물은 6.5 ML의 게시물 주입 버퍼, 하나의 우물 당 두뇌를 채우십시오 참고 : 사후 주입 버퍼는 표에 나와있는 키트에 들어 있습니다. <ol><li> 염화 수은 용액에서 (총) 14 일 후 dH 2 O로 조직을 헹구십시오. 그런 다음 post-impregnation buffer가있는 6-well plates로 옮깁니다. 호일로 판을 덮고 어두운 곳에서 실온에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 침지 1 일 후 사후 침투 완충액을 피펫 팅하고 신선한 사후 침투 완충액으로 갱신한다. 실온에서 어두운 곳에서 1 일 동안 보관하십시오. 필요한 경우 4 ° C에서 최대 1 개월 22 동안 보관하십시오. </li></ol> 4. 섹션 <ol><li> 뚜껑의 12- 웰 플레이트에 왼쪽에서 오른쪽으로 그리고 위에서 아래로 숫자가 오름차순으로 레이블을 붙입니다. </li><li> 전체 뇌를 절단하는 경우 뇌 당 2 ~ 3 개의 12- 웰 플레이트를 준비하십시오. <ol><li> 각 12 웰 플레이트 뚜껑의 상단에 분류 번호가 매겨진 뇌를 표시하십시오. </li><li> 각 플레이트의 각 우물에 1X PBS 2 ML 피펫. </li></ol></li><li> 스테이지를 설정하고 vibratome을 켜십시오. 조직에 충분한 1x PBS가 있는지 확인하십시오. <ol><li> 플라스틱 파라핀 필름 두 장을 자르고 두 번 접습니다. 시편 홀더 손잡이의 구멍에 올려 놓고 1x PBS가 카운터에 새어 나오지 않도록하십시오. </li><li> 시편 홀더의 티슈 블록에 테이프를 붙이고 시아 노 아크릴 레이트 접착제 접착제 (재료 표 참조)를 올려 놓으십시오. </li></ol></li><li> 6 - 웰 플레이트에서 두뇌를 제거하고 플라스틱이나 유리 접시에 놓습니다. 스테인리스 사용소뇌의 약 절반을 자르는 강철 양날 칼날. <ol><li> 소뇌를 꼬리로 자른다. 남아있는 소뇌 부분이 균일한지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 즉시 접착제에 남은 소뇌의 평평한 표면을 놓으십시오. 참고 : 조직 (대뇌 피질)의 지느러미 부분은 블레이드에 대해 왼쪽이나 오른쪽을 향해야합니다. 이전에 부착 된 후각 구를 포함하고 있던 주둥이 끝은 위쪽을 향해야합니다. <ol><li> 접착제가 완전히 마르도록 적어도 몇 분 정도 기다리십시오. </li></ol></li><li> 두뇌를 고정시키고있는 접착제가 건조되는 동안 1x PBS를 시험편 배스에 붓습니다. 접착제가 마른 후에, 표본 홀더를 조직과 함께 시험편 배스에 넣으십시오. <ol><li> 조직 샘플이 완전히 덮여 있지 않으면 표본 욕조에 1x PBS를 더 붓습니다. </li></ol></li><li> vibratome의 블레이드 홀더에 날을 장착하고 천천히 l블레이드가 1x PBS에 완전히 잠길 때까지 블레이드를 시험편 배스에 넣으십시오. 조직 상단보다 약간 아래쪽에 올 때까지 블레이드를 계속 낮 춥니 다. </li><li> vibratome 속도를 7, 진폭을 6, 절단 각도를 12 °로 설정하십시오 (vibratome 모델의 재료 표 참조). 진동을 시작하고 200 μm 구간을 자릅니다 23 . <ol><li> 큰 그림 붓을 사용하여 조직 섹션을 표본 욕조에서 12 개의 웰 플레이트의 지정된 각 웰로 이동하십시오. </li></ol></li><li> 원하는 수의 조직 절편에 도달 할 때까지 조직 절개를 계속하십시오. </li></ol> 5. 포스트 염색법 <ol><li> 다음의 각 염색 단계 및 헹굼물마다 웰당 지시 된 용액 2 mL를 사용한다. 전동 피펫 필러 (물질 표 참조)를 사용하여 용액을 우물로 옮긴다. 용액을 적당한 곳으로 옮기고 적절한 쓰레기로 옮기려면 전송 피펫 (재료 표 참조)을 사용하십시오컨테이너. </li><li> 0.01M PBS-T로 30 분간 1 회 씻으십시오 (0.01 M PBS 1,000 mL에 세제 3.0 mL를 넣으십시오). </li><li> 사용 직전에 dH 2 O로 수산화 암모늄 용액 (주의) 3 : 5를 희석하십시오. 희석 된 수산화 암모늄 용액에서 19-21 분 동안 부분을 염색합니다. <ol><li> 감광성 수산화 암모늄 용액을 호일로 보호하십시오. 참고 : 용액 내의 수산화 암모늄은 ~ 10 % 농도이며 &quot;위험한&quot;것으로 분류됩니다. 수산화 암모늄 용액은 피부에 접촉하면 화상을 입을 수 있습니다. 흡입하면 호흡기도 자극을 유발할 수 있습니다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오. </li></ol></li><li> 포스트 얼룩 버퍼 (500 ML dH 2 O에 시약 D 90g을 추가)에 섹션을 19 ~ 21 분 동안 얼룩. 포스트 염색 완충액은 빛에 민감합니다. 호일로 보호하십시오 22 . </li><li> 세 부분을 헹구십시오.0.01 M PBS-T를 5 ~ 10 분 세척 하였다. </li></ol> 6. 설치, 청소 및 덮음 <ol><li> 큰 붓으로 1 % 젤라틴 코팅 슬라이드에 섹션을 마운트하십시오. 실온에서 20-30 분 건조시키고 밤새 코플린 병에 넣으십시오. </li><li> Coplin 항아리에서 장갑을 낀 손으로 슬라이드를 꺼내 플라스틱 랙에 넣으십시오 (재료 표 참조). 플라스틱 랙을 100 % 에탄올이 들어있는 얼룩 접시 (재료 표 참조)에 넣습니다. 5 분 세 번 씻어서 탈수하십시오. </li><li> 99 % 크실렌으로 5 분씩 두 번 씻으십시오. 슬라이드를 유리 선반에 놓고 랙을 금속 손잡이가있는 크실렌이 들어있는 유리 얼룩이 진 접시에 내려 놓으십시오 (재료 표 참조). 참고 : 크실렌은 흡입하면 유해하며 피부에 닿으면 자극을 유발합니다. 그것은 액체 및 증기 상태에서 매우 가연성입니다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오. </li><li> 슬라이드를 xyl에서 꺼냅니다.한 번에 하나씩 주입하고 약 0.25 mL의 장착 매체로 조직을 신속하게 덮습니다 (재료 표 참조). 그런 다음 슬라이드 커버를 잡고 미디어 위에 올려 놓습니다. <ol><li> 슬라이드 덮개 아래의 갇힌 기포를 페인트 브러시의 끝과 같이 뾰족한 물체로 가장자리로 밀어 넣으십시오. </li></ol></li><li> 햇빛이 비치지 않는 곳에 슬라이드를 놓고 2 ~ 3 일 동안 말리십시오. </li><li> 현미경을 사용하여 이미지를 수집하고 적절한 소프트웨어로 분석하십시오. </li></ol> 7. 이미지 스택 획득 <ol><li> 이미징 프로그램을 엽니 다 ( 재료 표 참조). 슬라이드를 현미경 스테이지에 올려 놓습니다. 프로그램 상단의 메뉴에서 &#39;수집&#39;을 클릭 한 다음 &#39;라이브 이미지&#39;를 클릭하십시오. </li><li> 현미경을 10X로 설정합니다. 특혜의 뉴런을 확인하고 빨간색 X처럼 나타나는 커서를 soma의 중심으로 가져옵니다. 참조 점을 설정하려면 왼쪽 버튼을 클릭하십시오. </li><li> 현미경을 40X로 설정하십시오. 프로그램 상단의 메뉴에서 &#39;이동&#39;을 클릭 한 다음 &#39;참조 점&#39;을 클릭하십시오. </li><li> 초점이 약간 벗어날 때까지 조직 위의 미세한 대상을 수동으로 스크롤하여 이미지 스택을 만듭니다. <ol><li> &quot;Image Acquisition&quot;제목 아래에서 프로그램의 오른쪽 하단에있는 &quot;Set Top&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 약간 초점이 맞을 때까지 조직 아래로 살짝 스크롤 한 다음 &quot;Image Acquisition&quot;아래의 &quot;Set Bottom&quot;을 클릭하십시오. 그런 다음 &quot;이미지 스택 가져 오기&quot;를 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 이미지 스택을 얻은 후에 나타나는 창에 원하는 이미지 파일 이름을 입력하십시오. &quot;MBF Ascii 파일&quot;로 저장하십시오. <ol><li> 메시지가 나타나면 파일 형식을 &quot;MBF JPEG2000 stack file&quot;로 선택한 다음 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li></ol></li></ol> 8. 신경 추적 <ol><li> 툴바에서r 메뉴 아래의 &quot;Contour Name&quot;상자를 클릭하십시오. 드롭 다운 메뉴에서 &quot;Soma&quot;를 선택하십시오. </li><li> soma를 수동으로 추적하십시오. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 추적이 완료되면 &quot;셀 본문 완료&quot;를 선택하십시오. </li><li> &quot;AutoNeuron&quot;을 선택하여 &quot;AutoNeuron Workflow&quot;라는 다른 탭을 불러옵니다. </li><li> &quot;구성 유형&quot;에서 &quot;새로 만들기&quot;를 선택하십시오. 매개 변수를 설정하고 &quot;다음 단계&quot;를 클릭하여 &quot;Soma Detection&quot;소제목을 불러옵니다. <ol><li> 매개 변수를 설정하려면 &quot;Brightfield&quot;를 선택하십시오. 다음으로, &quot;Max Process Diameter&quot;에서 &quot;Start Measuring&quot;을 클릭하십시오. 커서를 사용하여 수상 돌기의 바닥으로 가서 수동으로 직경을 설정하십시오. </li></ol></li><li> 사용자가 전체 이미지를 추적하도록 요청하는 창에서 &quot;예&quot;를 클릭하십시오. soma를 수동으로 추적하십시오. 클릭 한 다음 &quot;다음 단계&quot;를 클릭하여 &quot;시드 배치&quot;소제목을 불러옵니다. </li><li> &quot;Validate Seed&quot;를 클릭하십시오.&quot;다음&quot;을 클릭하여 &quot;Neuron Reconstruction&quot;소제목을 불러옵니다. </li><li> &quot;Neuron&quot;에서 &quot;Interactive&quot;를 클릭하십시오. 수상 돌기의 프로그램 방향을 따라 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 프로그램에서 추적 한 강조 표시된 영역을 완료함으로써 대화식 추적을 수행하십시오. 모든 수상 돌기를 추적 한 후 &quot;다음 단계&quot;를 클릭하십시오. </li><li> 새 창이 나타나면 원하는 제목으로 새 구성을 저장하십시오. &#39;저장&#39;을 클릭하십시오. </li></ol> 9. 분석 <ol><li> 분석 프로그램을 엽니 다 (재료 표 참조). </li><li> 상단 메뉴에서 &quot;파일&quot;을 클릭 한 다음 &quot;데이터 파일 열기&quot;를 클릭하십시오. 원하는 파일을 선택하십시오. </li><li> 분석 소제목 아래에서 &quot;Sholl Analysis&quot;를 선택하십시오. </li><li> &quot;Sholl Analysis&quot;창에서 시작 반경을 10 μm로 설정하십시오. &quot;분석&quot;에서 &quot;수상 돌기&quot;및 &quot;지점 주문&quot;상자를 클릭하십시오. </li><li> 오른쪽 cl새로 열린 창을 클릭하고 &quot;Excel 내보내기&quot;를 클릭하십시오. &#39;저장&#39;을 클릭하십시오. </li><li> 분석 아래에서 &quot;Branched Structure Analysis&quot;를 클릭하십시오. &quot;가능한 모든 분석&quot;을 선택하십시오. </li><li> 새로 열린 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 &quot;Excel 내보내기&quot; 24를 클릭하십시오. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

보다 현대적인 기술에 비해 Golgi-Cox 방법은 척추 형태를 검사하는 데 선호되는 몇 가지 장점이 있습니다. 1) 염색은 본질적으로 모든 조직에 사용할 수 있습니다. 2) 기본적인 광학 현미경 설정만으로 모든 것이 가능합니다. 3) Golgi-Cox 이미징은 공 촛점 영상보다 빠르다. 4) Golgi 염색 된 절편은 형광 라벨이 부착 된 샘플보다 몇 개월에서 몇 년 더 오래 실행 가능하다. 이러한 장점을 가지고 있어도 Golgi-Cox 방법에는 여전히 한계가 있습니다. 첫째, 전체 프로세스가 매우 시간 소모적이어서 몇 주간의 얼룩이 필요하고 이미지를 분석해야합니다. 이 프로토콜에서 볼 수 있듯이, A 절에서 14 일, B 절에서 1 일이 소요되기 전에 절편을 시작할 수 있습니다. 또한 절단, 포스트 염색 및 마운팅 작업은 두뇌 당 2-3 시간이 소요됩니다. 각 슬라이드는 청소 및 덮기 전에 1 일 동안 건조해야합니다. 그 후 시간의 양그것이 섹션에 개인에 따라 달라집니다 이미지 및 분석 소요됩니다. 둘째, 척추 분류의 차이...

<html> Dendrites는 presynaptic 입력을 받아 처리하는 뉴런의 가장 큰 부분입니다 1 . 그들의 수지상 프로세스는 복잡한 기하학을 가지고 있는데, 근위부 가지가 원위부 가지보다 더 큰 직경을 가지고 있습니다. 수상 돌기가 발달함에 따라 돌기 arborization이라고하는 과정에서 다른 뉴런과 여러 연결을 형성합니다. 이 분기의 범위와 패턴은 수상 돌기가 적절하게 처리 할 수있는 시냅스 입력의 양을 결정합니다 2 . 수상 돌기 arborization은 활동 의존성 소성과 연결 회로의 적절한 개발을 위해 필요한 과정입니다. 확장, 후퇴, 분지 및 시냅스 생성은 내인성 유전 프로그램 및 외인성 요인으로부터의 영향을 포함하는 복잡한 과정이다. 해마 내의 신경성 수상 돌기의 형태 및 분지 변화는인지 및 기억 형성에 관련되어있다돌기 복잡성의 변화는 병리 생리학 및 행동 변화와 관련이있다 5. 이상은 X- 증후군 및 다운 증후군을 포함한 여러 질병 상태와 관련이있다. 수상 돌기 (dendritic spines)는 중추 신경계 내에서 흥분성 입력을받는 돌기 아버의 특화된 세포 내 구획입니다. 각 계통의 크기와 모양에 따라 3 가지 형태의 계통 분류가 있습니다. 1) 버섯 계통은 다른 계통보다 글루타메이트 수용체가 많은 복잡한 계피 밀도를 가지고 있습니다. 2) 줄기가없는 멍한 등뼈; 3) 길고 좁은 줄기와 구상 머리로 구성된 얇은 등뼈 8 . 돌기 척추 부피는 부분적으로 사용되어 얇은 척추가 일반적으로 더 작습니다 (0.01 μm 3 </sup&gt;)를 버섯 등뼈 (0.8 μm 3 )와 비교 9,10 . 등뼈는 성숙과 함께 안정됩니다. 예를 들어, 얇은 등뼈는 며칠 후에 수축되거나 버섯 등뼈로 발전합니다. 양자 택일로, 버섯 등뼈는 상대적으로 안정하고 오랜 기간 생존 할 수 있습니다. 연결 연결의 강도는 등뼈 및 / 또는 그들의 볼륨 11,12,13의 수를 기반으로 생각됩니다. 고전적인 Golgi 염색 방법과 그보다 현대적인 변형 모두 돌기의 척추 형태와 밀도를 검사하는데 유용합니다. Golgi 염색의 한 가지 독특한 측면은 무작위로 총 뉴런의 약 5 %를 얼룩이 지므로 개별 뉴런의 추적이 가능합니다 14 , 15 . 골지기의 정확한 메카니즘얼룩 개별 뉴런은 여전히 ​​알려져 있지 않습니다, 방법의 원리는은 크로메이트 (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 의 결정화를 기반으로합니다. Golgi 방법에는 세 가지 주요 유형이 있습니다 : 빠른 골지, Golgi-Cox 및 Golgi-Kopsch 18 , 19 . 세 가지 방법 모두 몇 일에서 몇 달 동안 크롬 염에서 초기 인큐베이션 단계로 시작하지만 몇 가지 주요 차이점이 있습니다. 빠른 Golgi는 첫 번째 단계에서 오스뮴 tetroxide를 사용하는 반면, Golgi-Kopsch는 paraformaldehyde를 포함합니다. rapid-Golgi와 Golgi-Kopsch에서의 염색은 약 7 일 동안 1 ~ 2 % 질산은 용액에서 배양한다. Golgi-Cox 방법은 질산은 대신에 염화 수은과 중크롬산 칼륨을 사용하며 2 ~ 4 주간의 함침 시간이 있습니다. 그 다음 조직을 절편 화하고 희석 된 암모니아염료를 제거하기위한 사진 용 정착액이 뒤 따른다. 세 가지 유형 중에서 골지 - 콕스 (Golgi-Cox) 방법은 배경 간섭이없는 돌기 아버를 염색하는 데 가장 좋은 것으로 여겨지는데 부분적으로는 크리스탈 아티팩트가 조직 표면에 발생하지 않기 때문에 (빠른 골지 방법과 달리) 17 , 20 , 21 . 현재의 방법은 상업적 골지 염색 키트와 함께 제공되는 프로토콜의 약간의 변형이며 5-Fu의 비교적 적은 양이 수지상 형태 학적 특성 및 척추 밀도에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위해 고안되었다. 획득 된 모든 데이터는 화학 요법 치료가 어떻게 신경 회로에 영향을 미치는지에 대한 더 많은 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>슈퍼골지 키트&nbsp;</td><td>바이오엔노 라이프사이언스</td><td>30100</td><td>&nbsp; 유해 물질이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>PBS 10x 분말 농축</td>액 <td>Fisher&nbsp;</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount&nbsp;</td><td>어부&nbsp;</td><td>SP 15-100</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 커버&nbsp;</td><td>어부&nbsp;</td><td>12-546-14</td><td></td></tr><tr><td>7 mL 이송 피펫&nbsp;</td><td>글로브 사이언티픽&nbsp;</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 팔콘 튜브&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td></td><td></td>352099</tr><tr><td>호일&nbsp;</td><td>어부&nbsp;</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>353043 200 proof 에탄올&nbsp;</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>자일렌&nbsp;</td><td>아크로스 오가닉스&nbsp;</td><td>1330-20-7</td><td>위험.&nbsp;</td></tr><tr><td>Permabond 200</td><td>Permabond LLC</td><td>GF2492</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 혈청학 피펫</td><td>Sigma</td><td>SIAL1489</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Midsci</td><td>HS234526C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>비브라톰&nbsp;</td><td>세계 정밀 기기&nbsp;</td><td>NVSLM1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 남성 마우스&nbsp;</td><td>잭슨 연구소&nbsp;</td><td></td><td></td>000664</tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>ZEISS</td><td>다중 구성 요소, 자세한 내용은 웹 사이트를 참조하십시오.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc 카메라</td><td>ZEISS</td><td>426508-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>염색 접시, 그린</td><td>티슈-텍</td><td>62541-12</td><td></td></tr><tr><td>염색 접시 세트&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학&nbsp;</td><td>70312-20</td><td></td></tr><tr><td>모터화된 피펫 필러&nbsp;</td><td>어부&nbsp;</td><td>03-692-168</td><td></td></tr><tr><td>뉴로루시다&nbsp;</td><td>mbf 생명과학&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>뉴로루시다 익스플로러&nbsp;</td><td>mbf 생명과학&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프리즘&nbsp;</td><td>그래프패드</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

수상 돌기는 흥분성 시냅스를 포함하는 신경 돌기 샤프트의 돌기입니다. 해마 내의 신경성 수상 돌기의 형태 및 분지 변이는인지 및 기억 형성에 관여한다. Golgi 염색에 대한 몇 가지 접근법이 있으며, 모두 수지상 세포의 형태 학적 특성을 결정하고 명확한 배경을 생성하는데 유용합니다. 현재 Golgi-Cox 방법 (상업적 골지 염색 키트와 함께 제공되는 프로토콜의 약간의 변형)은 비교적 낮은 용량의 화학 요법 약물 인 5- 플루오로 우라실 (5-Fu)이 수지상 형태에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위해 고안되었다 , 척추의 수 및 해마 안의 정강이 형성의 복잡성과 관련이 있습니다. 5-Fu는 수지상 복합체를 상당히 변조 시켰고, 해마 전역에서 척추 밀도를 영역 특이 적 방식으로 감소시켰다. 제시된 데이터는 Golgi 염색 방법이CA1, CA3 및 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 성숙한 뉴런을 fectively 염색했다. 이 프로토콜은 각 단계의 세부 사항을보고하여 다른 연구자가 뇌 전체에 걸쳐 조직을 안정적으로 얼룩지게하고 고품질의 결과와 최소한의 문제 해결을 가능하게합니다.

수상 돌기 arborization에 5 -Fu 처리의 효력 및 Golgi 얼룩 두뇌 단면의 해마에있는 복합성은 상업적으로 이용 가능한 화상 진찰 소프트웨어를 사용하여 정량되고 추적되었다. 추적 후, 돌기 arborization, 척추 밀도 및 척추 형태학은 Sholl 분석 및 수지상 복합 지수 (DCI)를 사용하여 분석되었습니다. Sholl 분석은 수지상 세포 형태를 결정하는 데 사용할 수있는 정량 분석 ​​방법입니다 25 . 소마 (soma)부터 시작해서, 서로 10μm 떨어져있는 원들은 돌기 추적을 오버레이합니다. 수상 돌기의 길이는 돌기가 교차하는 원의 수에 의해 결정됩니다. 돌기 아버의 복잡성을 확인하는 방법 인 분기점 분석은 분기점의 총 수와 순서를 기반으로합니다. 분기점은 다음과 같이 정의됩니다.브랜치는 두...

여기서 우리는 Golgi-Cox 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 신뢰할 수있는 조직 얼룩 방법은 최소한의 문제 해결과 함께 해마 및 전체 뇌에 걸쳐 cytoarchitecture의 높은 품질 평가를 허용합니다.

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

이 방법론의 전반적인 목적은 수지상 돌기의 형태와 복잡성을 조사하고 정량화하기 위해 뇌 조직을 적절하게 골지 염색(Golgi stain)하는 것입니다. 이 방법은 신경과학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 골지 염색은 소수의 세포만을 염색하므로, 이 기술은 뉴런의 구조를 추적하는 데 사용될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 세척 단계 중에 뇌 절편이 건조되거나 탈락할 위험 없이 쉽게 염색할 수 있다는 것입니다. 실험 절차 시연은 Allen 박사 연구실의 대학원생인 Fred Kiffer, Tyler Alexander, Julie Anderson이 진행합니다. 우선, 갓 채취하여 고정되지 않은 설치류의 뇌 반구를 5 mL의 염화수은 기반 용액에 담그는 것으로 시작하십시오.염화수은 용액은 빛에 민감하므로 튜브를 호일로 감싸십시오. 샘플은 실온의 암소에 보관하십시오. 다음 날, 용액을 임시 용기에 천천히 따라낸 후 바이오하자드 폐기물 용기에 적절히 폐기하십시오.신선한 염화수은 용액 5 mL를 추가하고 뇌 조직이 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 샘플을 실온의 암소에 13일 더 보관하십시오. 14일 후, 분말 형태의 post-impregnation buffer 30 g을 증류수 또는 탈이온수(DH2O) 90 mL에 추가하여 post-impregnation buffer를 준비하십시오.6-웰 플레이트의 각 웰에 뇌 조직 하나당 하나씩, 포스트-임프레그네이션 버퍼 6.5 milliliters를 채웁니다. 그 다음, 이전과 동일하게 뇌 조직에서 염화수은 용액을 제거합니다. 조직을 DH2O로 헹군 후, 포스트-임프레그네이션 버퍼가 들어 있는 6-웰 플레이트로 조직을 옮깁니다.플레이트를 호일로 덮고 상온의 암소에 보관하십시오. 다음 날, 포스트 임프레그네이션 버퍼(post-impregnation buffer)를 흡입하여 제거한 후 새 버퍼로 교체하십시오. 플레이트를 다시 덮어 4°C 냉장고에 보관하십시오.뇌 조직 하나당 두 개 또는 세 개의 12-웰 플레이트를 준비하며, 먼저 플레이트 뚜껑에 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 오름차순으로 번호를 기입하여 라벨링합니다. 절편화된 뇌의 식별 번호를 추가합니다. 각 플레이트의 모든 웰에 1X PBS 2 mL를 피펫으로 분주한 다음, 스테이지를 설정하고 바이브라톰을 켭니다.그 다음, 시료 홀더의 조직 블록에 테이프를 붙이고 그 위에 시아노아크릴레이트 접착제를 소량 도포합니다. 6-웰 플레이트에서 뇌를 꺼내 플라스틱 또는 유리 접시 위에 놓습니다. 스테인리스 스틸 양날 면도날을 사용하여 소뇌의 후방 부위를 절단하며, 이때 뇌에 남아 있는 소뇌 부분이 평평하도록 합니다.그런 다음, 남은 소뇌의 평평한 면을 접착제 위에 놓습니다. 접착제가 마르면 조직이 부착된 시편 홀더를 시편조에 넣습니다. 시편조를 바이브라톰(vibratome) 위에 올리고 조직 시료가 PBS에 잠기도록 덮어줍니다.그 다음, 날을 바이브라톰(vibratome)의 날 홀더에 부착하고, 날이 완전히 잠겨 조직의 상단보다 약간 낮아질 때까지 시료 조(specimen bath) 안으로 천천히 내립니다. 이어서, 바이브라톰의 속도를 7, 진폭을 6, 절단 각도를 12도로 설정합니다. 진동을 시작하여 200-micron 두께로 절편을 제작합니다.큰 페인트 브러시를 사용하여 조직 절편을 시료조에서 12-웰 플레이트의 각 지정된 웰로 옮깁니다. 원하는 수의 조직 절편이 확보될 때까지 계속해서 조직을 절단합니다. 절단 후, 전송 피펫을 사용하여 12-웰 플레이트의 웰에서 PBS를 흡입하여 제거한 다음, 2 mL의 PBS-T를 첨가하고 교반하며 30분 동안 세척합니다.세척 기간이 끝나갈 무렵, 수산화암모늄 용액 3분량과 DH2O 5분량을 혼합하여 희석합니다. 그런 다음 PBS-T를 제거하고, 희석된 수산화암모늄 용액을 첨가합니다. 호일로 빛을 차단하고 절편을 19분에서 21분 동안 염색합니다.그 후, 수산화암모늄 용액을 안전하게 제거하고 염색 후 완충액(post-staining buffer)을 첨가합니다. 알루미늄 호일로 감싸 보호한 상태에서 19~21분 동안 추가로 염색합니다. 마지막으로 PBS-T로 섹션을 3회 헹구며, 각 회당 5~10분씩 수행합니다.큰 페인트 브러시를 사용하여 절편을 1% 젤라틴 코팅 슬라이드에 부착합니다. 상온에서 20~30분 동안 건조시킨 후, Coplin Jar에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. Coplin Jar에서 슬라이드를 꺼내 흄 후드 내의 플라스틱 랙에 놓습니다.100% ethanol이 들어 있는 염색 접시에 5분 동안 둡니다. 두 번 더 5분씩 ethanol 세척을 하여 절편을 탈수합니다. 다음으로, 슬라이드를 유리 랙에 넣고 금속 핸들을 사용하여 랙을 99% xylene이 들어 있는 유리 염색 접시에 넣습니다.슬라이드를 두 번에 걸쳐 각각 5분 동안 자일렌으로 세척합니다. 두 번째 세척 시간이 지나면 슬라이드를 자일렌에서 하나씩 꺼내어 조직 위에 약 0.25 milliliters의 마운팅 용액을 빠르게 도포합니다. 그다음, 커버 글라스를 사용하여 용액 위에 덮어줍니다.붓 끝과 같은 뭉툭한 도구를 사용하여 슬라이드 커버 아래에 갇힌 기포를 가장자리로 밀어냅니다. 슬라이드를 직사광선이 닿지 않는 곳에 두고 2~3일 동안 건조시킵니다. 건조 후, 현미경을 사용하여 이미지를 획득하고 적절한 소프트웨어로 분석을 진행합니다.이 명시야 이미지는 이미징 및 추가 분석 기준을 충족하는 Golgi 염색된 뉴런을 보여줍니다. 세 가지 유형의 스파인을 모두 쉽게 확인할 수 있습니다. 염색은 수상돌기 전체 길이에 걸쳐 일정하며, 해당 수상돌기는 다른 뉴런들과 분리되어 있습니다.이 그림은 5-fluorouracil 처리 후 치상회(Dentate Gyrus) 내의 Golgi 염색된 뉴런이 식염수 처리군과 비교하여 4차 및 6차 분지에서 길이가 감소했음을 보여줍니다. Golgi 염색은 가시(spine) 밀도의 유의미한 차이를 검출하는 데 사용될 수 있습니다. 생쥐에 5-fluorouracil을 투여했을 때 CA1 첨단 피라미드 수지상 돌기의 가시 밀도가 유의미하게 감소했습니다.기저 수지상 돌기에서는 가시(spine)의 전반적인 밀도에 유의미한 변화가 없었습니다. CA1 정단 피라미드 수지상 돌기에 대한 Sholl 분석 결과, 5-fluorouracil 처리는 세포체(soma)로부터 40에서 160 µm 사이의 거리에서 수지상 분지(dendritic arborization)를 유의미하게 감소시킨 것으로 나타났습니다. 기저 수지상 돌기에서는 5-fluorouracil 처리가 세포체로부터 30에서 110 µm 떨어진 곳의 수지상 분지를 감소시켰습니다.이 기술을 숙달하면, 골지 염색 과정과 마운팅, 세척 및 커버링을 모두 포함하여 적절히 수행했을 때 뇌 하나당 3시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 신경생물학 분야의 연구자들은 마우스 모델에서 신경해부학적 연결성을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 절차를 수행할 때, 뉴런이 과염색되지 않도록 절편을 수산화암모늄 용액에 19분에서 21분 동안만 유지하는 것이 중요함을 기억하십시오.이 영상을 시청한 후, 뇌 조직을 적절하게 염색, 절편 제작 및 세척하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 염화수은 기반 용액, 수산화암모늄 용액 및 자일렌을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 주의 사항을 준수하고 실험실 장갑을 착용하며 흄 후드 내에서 작업하시기 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

stereomicroscope 이하 성인 마우스에서 이가있는 이랑의 제거를위한 해부 기술이 비디오 녹화 프로토콜에서 시연되었다.

성인 마우스 Hippocampal 이가있는 이랑의 해부

이 문서는 뇌의 노화 및 알츠하이머 질환 같은 나이와 관련된 neurodegenerative 질병와 관련된 시냅스 변경의 연구를위한 유전자 변형 쥐 및 생쥐에서 hippocampal 조각 준비 절차를 설명합니다.

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

이 논문은 쥐의 새끼의 촉각 자극과 신경 세포의 형태의 후속 골지 - 콕스 염색에 대한 절차를 설명합니다. 촉각 자극은 가정용 먼지 떨이로 새끼를 쓰다듬어하여 주 산기 투여되는 긍정적 인 경험이다. 골지 - 콕스 염색은 전체 신경 세포의 시각화를 허용하는 신뢰할 수있는 절차입니다.

골지 콕스 염색과 돌기​​ 형태와 시냅스 연결에 대한 긍정적 인 초기 경험, 촉각 자극의 효과를 시각화

우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

정확 하 게 파악 하 고 분석 hippocampal 조각 면역 형광을 사용 하 여 시 냅 스에 대 한 프로토콜은이 문서에 설명 되어.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

이 프로토콜의 목표는 특정 국소 신경 회로의 화학 유전적 조작에 응하여 성인 신경 줄기/전구 세포의 행동을 분석하기 위한 접근법을 설명하는 것입니다.

성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

이것은 조직에 저산소 손상을 줄이기 위해 얼음 차가운 NMDG-aCSF와 함께 경내 관류 및 슬라이스 절단을 활용하는 성인 및 노화 마우스 해마의 급성 슬라이스 준비를위한 프로토콜입니다. 결과 슬라이스는 여러 시간 동안 건강하게 유지되며 장기 패치 클램프 및 필드 레코딩에 적합합니다.

성인과 노화 마우스에서 해마 조각에서 저산소증 최소화

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

이 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질에서 뉴런을 염색하기 위해 신경계의 모든 부분에 적응할 수있는 신속한 골지 방법의 변형을 기술합니다.

해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩

학습하세요 뇌 조직의 Golgi-Cox 염색법을 통해 해마 신경세포의 수지상 돌기 복잡성을 평가하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구에서 신경 구조를 정밀하게 분석하는 데 필수적인 도구입니다.

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

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