Лабораторные методы, используемые для поддержания и дифференциации биотипов

Общая цель данной методики заключается в предоставлении набора простых в исполнении протоколов, которые помогут любому исследователю охарактеризовать конкретный клинический или экологический изолят Vibrio cholerae. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области бактериологии, такие как определение специфических генотипических и фенотипических характеристик любого изолята Vibrio cholerae, особенно имеющих клиническое значение. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет любому исследователю использовать этот набор анализов для надежной характеристики и дифференциации клинических или экологических изолятов Vibrio cholerae.

В совокупности эти анализы представляют собой систематический подход, который может быть использован в качестве альтернативы или дополнения к дорогостоящим и трудоемким экспериментам по характеристике клинических и экологических изолятов Vibrio cholerae. Хотя данный метод позволяет получить сведения о характеристиках биотипов Vibrio cholerae, он также может быть применен для изучения биохимических и метаболических возможностей других кишечных бактерий. Как правило, лицам, впервые осваивающим этот метод, может быть сложно распределить время, так как время инкубации, необходимое для получения оптимальных результатов, различается для разных биохимических анализов.

Визуальные демонстрации протоколов споттинга и посева методом укола имеют решающее значение, так как разбрызгивание часто приводит к перекрестному загрязнению, а для предотвращения слияния культур требуется максимальное расстояние между ними. Начните выполнение протокола с осаждения 1,8 mL жидкой ночной культуры путем центрифугирования в течение двух минут при минимальном ускорении 8 600 xG в стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 2 mL. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 900 mcL свежего бульона Luria-Bertani или LB путем пипетирования.

Затем добавьте в культуру 900 mcL стерильного 60% объемно-объемного глицерина и перемешайте с помощью вортекса. Перенесите смесь в стерильную криопробирку объемом 2 mL и хранитеt сток-культуру при температуре 80 °C. Для использования стока с помощью стерильной инокуляционной петли возьмите небольшое количество замороженного стока и произведите посев бактерий штрихом для получения единичных колоний на чашках с LB-агаром.

Сразу после использования верните замороженный сток при температуре -80 °C, чтобы предотвратить полное размораживание культур. Инкубируйте чашки перевернутыми (крышкой вниз) в течение 12-16 часов при 37 °C. Возьмите предварительно подготовленную чашку.

Внесите одну колонию в 4 mL жидкого бульона LB в стерильной культуре пробирке объемом 10 mL, коснувшись поверхности одиночной колонии стерильной петлей и перенеся ее в жидкий бульон. Затем инкубируйте культуру с аэрацией в шейкере-инкубаторе при 225 rpm в течение 12-16 часов при 37 °C. Подготовьте ночную культуру в жидком бульоне LB.

На следующий день осадите культуру и промойте клетки, повторно суспендировав клеточный осадок в 1,8 mL 1x фосфатно-солевого буфера или PBS. Повторите процедуру промывки трижды. После третьей промывки выполните окончательное перевзвешивание в 1,8 mL 1x PBS.

Затем с помощью наконечника пипетки нанесите 1 mcL промытой культуры на соответствующую среду. Промойте осадок клеток, полученный после ночного культивирования. Для инокуляции чашек с агаром для определения подвижности погрузите инокуляционную петлю в промытую жидкую культуру и совершите вертикальный прокол среды.

Следите за тем, чтобы инокуляционная петля не сгибалась при прокалывании агара. После каждого инокулирования стерилизуйте проволочную петлю в пламени горелки Бунзена. Инкубируйте чашки крышкой вверх в течение 14-24 часов при 37 °C.

Спустя 14 часов внимательно следите за пластинами для определения подвижности, чтобы предотвратить чрезмерный рост культур. Для инокуляции 4 мл бульона для теста на метиловый красный и Фогеса-Проскауэра (MR-VP) внесите пипеткой 10 mcL предварительно подготовленной ночной культуры в 4 мл бульона MR-VP в стерильную пробирку и инкубируйте с аэрацией в шейкер-инкубаторе при 225 rpm в течение 12-16 часов при 37 degrees Celsius. Затем к аликвотам ночной культуры MR-VP объемом 1 мл в стерильных пробирках добавьте 150 mcL 5% (масса/объем) альфа-нафтола и 50 mcL 40% (масса/объем) гидроксида калия соответственно.

Затем коротко перемешайте содержимое пробирок на вортексе. Оставьте пробирки при комнатной температуре до четырех часов до появления изменения цвета. Референтные штаммы биотипов и репрезентативные варианты El Tor были включены в базовый генетический скрининг методом ПЦР и фенотипический анализ для разграничения биотипического происхождения клинических и экологических изолятов V.Cholerae.

Дикий тип классического штамма O395 продемонстрировал классические последовательности ctxB и tcpA. Напротив, штаммы дикого типа El Tor N16961 и C6706 продемонстрировали последовательности ctxB и tcpA биотипа El Tor. Штаммы MQ1795 и BAA-2163 содержат субъединицу ctxB классического биотипа, сопоставимую с O395.

Тем не менее оба варианта El Tor содержали tcpA, что указывает на генетический фон биотипа El Tor. При культивировании на чашках с LB-агаром с добавлением полимиксина B штамм 0395 классического биотипа дикого типа проявил чувствительность к полимиксину B, тогда как штамм биотипа El Tor дикого типа проявил резистентность. Репрезентативные варианты штаммов El Tor продемонстрировали аналогичную устойчивость к данному антибиотику.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как различать биотипы Vibrio cholerae с помощью системы комплексной идентификации, описанной в данной статье. Не забывайте, что работа с патогенами уровня BSL-2 может быть чрезвычайно опасной, поэтому надлежащее обращение и утилизация всех материалов и отходов должны осуществляться в строгом соответствии с институциональными, местными, региональными и федеральными нормами. В дополнение к протоколам, представленным в данной статье, дальнейшая характеристика изолятов Vibrio cholerae может быть достигнута путем изучения других фенотипических свойств, таких как образование биопленок и аутоагглютинация.