Name: Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van In Utero Elektroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Leer tijd-afbeelding confocale microscopie van migrerende neuronen in organotypische snijcultuur van embryonale muizenhersenen met in utero elektroporatie. Deze methode onthult moleculaire mechanismen van neuronpolarisatie en migratie tijdens neocorticale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka en Matthias Toberer voor uitstekende technische bijstand, evenals Victor Tarabykin voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de Deutsche Forschungsgemeinschaft aan SB (BR-2215).

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Animal Welfare Committee (Regierungspräsidium Tübingen) en uitgevoerd volgens de Duitse dierenwelzijnswet en de EU-richtlijn 2010/63 / EU. 1. In Utero Electroporation <ol><li> Microinjectie Naalden <ol><li> Draai borosilicate glazen capillairen (buitenste diameter: 1,0 mm, binnendiameter: 0,58 mm, lengte: 100 mm) in microinjectienaalden met behulp van een micropipettractor met een doosfilament (2,5 mm x 2,5 mm) en het volgende programma: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20, en DELAY: 140. Bepaal de HEAT-waarde voor elk afzonderlijk filament door een RAMP-test uit te voeren (HEAT-waarde: RAMP + 25). </li><li> Bevelnaalden in een hoek van 38 ° en tussenliggende tot hoge omwentelingssnelheid met een microgrinder om een ​​tipgrootte van 20 tot 30 μm te verkrijgen voor injectie op embryonale dag (E) 13,5 of jonger en 30 tot 40 μm voor injectie bij oudere embryonalefasen. Voor het opslaan, doe de naalden in een doos of petrischaal met modelleerklep om schade aan de tips te voorkomen. </li></ol></li><li> Plasmide DNA-oplossing <ol><li> Bereid het plasmide-DNA-construct dat fluorescerend reporterproteïne ( bijv. GFP) bevat, met gebruik van een endotoxinevrije maxi-bereidingskit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Verdun plasmide-DNA-oplossing tot een eindconcentratie van 1 - 2 μg / μl in endotoxinevrije Tris-EDTA-buffer die Fast Green bij een uiteindelijke concentratie van 0,01% bevat. Aliquot oplossing en opslaan bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Bacteriostatische Sodium Chloride Oplossing <ol><li> Bereid de bacteriostatische natriumchlorideoplossing door benzylalcohol toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,9% aan isotonische 0,9% natriumchloride oplossing. Steriele filteroplossing direct voor gebruik. </li></ol></li><li> Carprofen injectie oplossing <ol><li> Bereid de carprofen injectie oplossing voorCarprofen toevoegt aan een uiteindelijke concentratie van 0,5 mg / ml aan steriele isotonische 0,9% natriumchloride oplossing. Bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 28 dagen. </li></ol></li><li> Anesthesie, DNA-injectie en Elektroporatie <ol><li> Weeg een E14.5 timed-pregnant muis en plaats het in een doorzichtige verdovingskamer die verbonden is met een verdamper en verzadigd is met 5% isofluraan. Wanneer het dier bewusteloos is, breng het over naar een verdovingsmasker dat is bevestigd aan een warmteplaat van 37 ° C en verdoof het met 1,8-2,2% isofluraan. Opmerking: Bepaal de ontwikkeling van de chirurgische verdoving door verlies van staartknijp en pedaalreflexen (teenknijp). </li><li> Voor analgesie injecteer 100 μL carprofen injectie oplossing per 10 mg muis lichaamsgewicht (5 mg / kg lichaamsgewicht) subcutaan. Draai de muis met de rug naar beneden en bedek de ogen zorgvuldig met petroleumjelly om te voorkomen dat ze drogen. </li><li> Verdeel de ledematen voorzichtig uit en fixeer zeNaar de verwarmingsplaat met chirurgische tape. Steriliseer de buik met 70% ethanol gevolgd door een jodiumoplossing (7,5 mg / ml) met behulp van cellulose swabs. Herhaal deze procedure drie keer om te zorgen voor een goede desinfectie. </li><li> Bedek de buik met steriel gaas, waarin een snede is gesneden om een ​​veld (diameter: 2 - 2,5 cm) voor de buikspleet te sparen. Bevestig het gaas met bacteriostatische natriumchloride oplossing. Let op: Herzien de ontwikkeling van de chirurgische verdoving door het verlies van het pedaalreflex. </li><li> Met behulp van Micro Adson Forceps (serrated, lengte: 12 cm) en fijne schaar (hoek aan zijde, lengte: 9 cm) snijd je de huid ongeveer 1,5 cm langs de middellijn van de buik. Snijd de onderliggende spier langs de linea alba. </li><li> Verwijder een baarmoederhoorn met ringpincet (lengte: 9 cm, buitendiameter: 3 mm, binnendiameter: 2,2 mm) en plaats het zachtjes op het bevochtigde gaas. Voorzichtigheid: Houd de baarmoederhoorn alleen met ringpincen tussen de embryo&#39;s anD versteur de placentas of geen voedingsschepen. Houd de baarmoeder te allen tijde vochtig met bacteriostatische natriumchlorideoplossing. </li><li> Plaats een embryo voorzichtig met ringpincet en plaats de laterale ventrikel, die als een halve maanvormige schaduw voordoet parallel aan de sagittale sinus. De injectieplaats ligt ongeveer in het midden van een lijn tussen het gepigmenteerde oog en de samenloop van sinussen, waar de sagittale sinus tot twee dwarse sinussen grenst. Duw de microinjectie naald door de baarmoederwand en in de laterale ventrikel. Opmerking: Indien nodig kan de diepte van de injectie gecorrigeerd worden door de naald terug te trekken. </li><li> Spuit 1 tot 2 μL DNA-oplossing in de laterale ventrikel met een microinjector, die met een voetpedaal wordt bediend, met de volgende instellingen: 25 psi, 10 tot 20 ms per puls en 5 tot 10 pulsen. Succesvolle injectie kan worden gecontroleerd door de gekleurde DNA-oplossing, die het ventriculaire systeem moet vullen. </li><li> Plaats tweezers-type elektroden (3 mm diameter voor E13.5 of jonger en 5 mm diameter voor E14.5 of ouder) op zodanige wijze dat de &#39;positieve&#39; aansluiting op dezelfde zijde ligt als de geïnjecteerde ventrikel en de &#39;negatieve&#39; Terminal is aan de andere kant van de ingespoten ventrikel onder het oor van het hoofd van het embryo. </li><li> Vocht de elektroporatieplaats met een paar druppels bacteriostatische natriumchlorideoplossing aan en gebruik 5 elektrische stroomimpulsen (35 V voor E13.5 of jonger en 40 V voor E14.5 of ouder) met een duur van 50 ms met intervallen van 950 ms. Opmerking: Stromen van 60 tot 90 mA zijn meestal voldoende voor succesvolle elektroporatie. Lagere stromen zullen de neuronen niet efficiënt transfecteren, terwijl hogere stromen tot embryonale dood kunnen leiden. </li><li> Herhaal de procedure (zie stap 1.5.7 tot en met 1.5.10.) Voor elk embryo van de baarmoederhoorn en plaats het zachtjes terug in de buikholte. </li><li> Verwijder de baarmoederhoorn van de andere kant en herhaal de procEdure beschreven in stap 1.5.7. Tot 1.5.11. </li><li> Sluit de buikholte door de spierlaag te suturen voordat u de huid met behulp van Micro Adson Forceps, Mathieu Naaldhouder (wolfraamcarbide, lengte: 14 cm) en niet-absorbeerbare chirurgische hechting (3/8 cirkel, 13 mm, taps punt) helpt. Let op: Wees voorzichtig om de baarmoeder of andere organen tijdens de hechting niet vast te leggen. </li><li> Desinfecteer de huidverhitting met de jodiumoplossing (7,5 mg / ml) zorgvuldig en verwijder het perioculaire overmaat petroleumjessje met behulp van cellulose swabs voorzichtig. Plaats de muis onder een infraroodlamp totdat het wakker wordt. Volg de muis nauwkeurig de komende twee dagen. Herhaal de analgesische behandeling zoals beschreven in stap 1.5.2 na 12 tot 24 uur. </li></ol></li></ol> 2. Organotypische Slice Culture <ol><li> Laminin Stock Solution <ol><li> Los 1 mg gevriesdroogde laminine op in steriel water om een ​​1 mg / ml laminine voorraadoplossing te verkrijgen. Bereid 50 μl alikvoten aNd winkel bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Poly-L-lysine voorraadoplossing <ol><li> Los 50 mg poly-L-lysine op in steriel water om een ​​1 mg / ml poly-L-lysine voorraadoplossing te verkrijgen. Bereid 0,5 ml porties op en houd deze bij -20 ° C op. </li></ol></li><li> Complete Hank&#39;s Balanced Salt Solution (Complete HBSS) <ol><li> Bereid complete HBSS voor door 50 ml 10x HBSS oplossing, 1,25 ml 1 M HEPES buffer (pH 7,4), 15 ml 1 M D-glucose oplossing, 5 ml 100 mM calciumchloride oplossing, 5 ml 100 mM magnesiumsulfaat Oplossing en 2 ml 1 M natriumwaterstofcarbonaatoplossing. Voeg steriel water op tot 0,5 L, steriel filter, en sla bij 4 ° C op. </li></ol></li><li> Slice Culture Medium <ol><li> Combineer 35 ml Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml volledige HBSS (zie sectie 2.3.1.), 1,35 ml 1 M D-glucose, 0,25 ml 200 mM L-glutamine en 0,5 ml penicilline streptomycine tot 50 ml snijcultuur verkrijgenmedium. Steriel filter en voeg parserum toe tot een uiteindelijke concentratie van 5%. Bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 4 weken. </li></ol></li><li> Laag Smeltpunt (LMP) Agarose Oplossing <ol><li> Bereid 3% LMP-agaroseoplossing door 1,5 g LMP-agarose in 50 ml volledige HBSS op te lossen door 1 tot 2 minuten in een magnetron te verwarmen bij tussenvermogen. Opmerking: Bewaar de hitte zorgvuldig om overloop te voorkomen tijdens het koken. </li><li> Plaats de oplossing in een waterbad bij 38 ° C tot het klaar is voor gebruik. Bewaar bij 4 ° C en herhaal eens. </li></ol></li><li> Coating van membraaninzetstukken <ol><li> Voeg één aliquot van laminine voorraadoplossing toe (cf stap 2.1.1.) En één aliquot van poly-L-lysine voorraadoplossing (zie stap 2.2.1.) Tot 6 ml steriel water om een ​​coatingoplossing te verkrijgen (voldoende voor 6 inserts) . </li><li> Plaats membraaninzetten in een 6-putjesplaat die 2 ml steriel water in de bodem van elke put bevat. Voeg 1 ml coatingoplossing toe(Zie stap 2.6.1.) Bovenop elk membraan en incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% kooldioxide atmosfeer. Opmerking: Gebruik alleen inserts met optisch heldere membranen, zoals polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan. </li><li> Was de membranen driemaal met 1 ml steriel water en droog. Gebruik de gecoate membranen op dezelfde dag of op een schone plaat met 6 putjes bij 4 ° C gedurende maximaal vier weken. </li></ol></li><li> Hersensectie en inbedding <ol><li> Twee dagen na de elektroporatie plaats de muis in een transparante kamer die is verbonden met een verdamper en verzadigd met 5% isofluraan. Als het dier onbewust is, verwijder het het uit de kamer en offer het door cervicale ontwrichting. </li><li> Verwijder de baarmoeder die de embryo&#39;s bevat en plaats het in een 10 cm Petri-schotel met ijskoude complete HBSS. Opmerking: houd vanaf dit punt alle oplossingen, embryo&#39;s en hersenen op ijs. </li><li> Gebruik een stereomicroscoop, fijne tippen (recht,11 cm) en een paar Vannas Tübingen Spring Scissors (omhoog omhoog, lengte: 9,5 cm) om elk embryo van de baarmoeder af te scheiden en over te brengen naar een andere petrischaal met ijskoude complete HBSS. </li><li> Maak een snede op het niveau van de hersenstam en snijd langs de sagittale middenlijn. Verwijder de huid en kraakbeen over de hersenen. Knip de hersenstamper direct achter de hemisferen af ​​en verwijder de hersenen van de schedel. Breng de hersenen over met een microsleepspatel (185 mm x 5 mm) op een 12-putjesplaat met ijskoud complete HBSS. Verzamel alle hersenen uit het rommel in de 12-putjesplaat. </li><li> Gebruik een fluorescerende stereomicroscoop om de hersenen in de 12-putsplaten te screenen voor fluorescentiehelderheid evenals de grootte van het elektroporiseerde gebied. Selecteer 2 tot 4 hersenen met fel fluorescerende signalen in de vermoedelijke somatosensorische cortex voor verdere verwerking. </li><li> Giet 3% LMP-agarose-oplossing die bij 38 ° C wordt gehouden in de wegwerpbeschermingsbeschermer. afneemE-hersenen uit de 12-putjesplaat met een microsleepspatel en zorg ervoor dat overtollig gehele HBSS om de hersenen wordt afgedekt met fijn tissuepapier. </li><li> Plaats de hersenen zachtjes in de agarose-oplossing, duw het naar de bodem van de mal en pas de positie zorgvuldig aan met behulp van een 20-gaas naald. Voor coronale afdelingen, geef de hersenen aan met de olfactorische bollen naar boven gericht. Houd de mal op ijs totdat de agarose-oplossing is verstevigd en doorgaan met het doorsneden van de hersenen. </li></ol></li><li> Vibratome Sectie en Slice Culture <ol><li> Verwijder het agarose blok uit de vorm en plaats het op de deksel van een steriele petrischaal. Vermijd overmatige agarose met een schoon razorblad dat ongeveer 2 tot 3 mm onder de olfactorische bollen en 1 mm agarose aan de andere zijden achterlaat. Bevestig het geperforeerde agarose blok met de olfactorische bollen naar beneden naar een monsterstadium met behulp van cyanoacrylaatlijm. Opmerking: Instrumenten en apparatuur steriliseren met 70% ethanoIk voor afsnijden. </li><li> Breng het specimen stadium naar de snijkamer van een vibrerende mesmikrotoom die ijskoud volledige HBSS bevat en plaats de hersen met zijn dorsale kant naar het mes. Snijd 250 μm dikke schijfjes die het elektroporate gebied bevatten met een lage tot matige amplitude van 0,9 mm en een zeer langzame snijsnelheid van 0,09-0,12 mm / s. Meestal worden 4 tot 6 segmenten met helder fluorescent signaal verkregen uit elke succesvolle elektroporate hersen. </li><li> Met een gebogen microsleepspatel en fijne tipped tang, verplaats de hersenschijfjes zorgvuldig met de omliggende agarose naar een 6-putjesplaten die ijskoude complete HBSS bevatten. Let op: Wees voorzichtig om het hersenweefsel niet te beschadigen door alleen de agarose velg rond de secties aan te raken met de tang tijdens de overdracht. </li><li> Verwerk alle geselecteerde hersenen zoals beschreven in stappen 2.8.1. Tot 2.8.3. </li><li> Vochtig de membraan inserts met 100 μL complete HBSS voordat u de hersenen slWijst op de membranen om de positionering van de plakjes te vergemakkelijken. Er kunnen maximaal 5 plakjes op 1 membraan inzet geplaatst worden. </li><li> Zet de plakjes zorgvuldig over op de membranen door middel van een gebogen microsleepspatel en fijne tippen. Zet een plakje voorzichtig op de spatel door alleen de agarose velg aan te raken met de tang en druk het plakje voorzichtig van de spatel op het membraan. Plaats het plakje met behulp van tang en ga door met de resterende plakjes. Verwijder overmaat complete HBSS met een pipet. Opmerking: overlap de plakjes niet met elkaar. </li><li> Plaats de membraaninzetten zorgvuldig met de plakjes in een 6-putjesplaat die 1,8 ml snijcultuurmedium bevat (cf stap 2.4.1.) En incubeer bij 37 ° C en 5% kooldioxide atmosfeer tot de vervaldatum in beeld brengen. </li></ol></li></ol> 3. Time-Lapse Imaging <ol><li> Microscoop Setup <ol><li> Zet een klimaatkamer op het podium van eenOmgekeerde confocale microscoop naar 37 ° C en 5% kooldioxide atmosfeer. Gebruik een hybride detector om de laserintensiteit te verminderen en de levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren. Voor gedetailleerde analyse gebruik een extra lange werkafstand 40X droge doelstelling met een numerieke diafragma van 0,6 of hoger. Opmerking: Alle componenten van de microscoop moeten gedurende 2 tot 3 uur voor 37 ° C worden verwarmd tot 37 ° C voor beeldvorming om tijdens de beeldvorming een stabiele focus te bieden. </li></ol></li><li> Slice Imaging <ol><li> Selecteer een breinschijf voor beeldvorming van de 6-putjesplaat die de membraaninzetten bevat met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Let op: Vermijd langdurige blootstellingstijd aan ultraviolet licht, omdat dit kan leiden tot cellulaire fotodamage. Opmerking: Selecteer een segment met lichte enkele neuronen in de bovenste SVZ die radiaal migreert naar het pale oppervlak van de plak. Fijne fluorescerende processen van radiale glialcellen die de gehele CP bedragen, duiden op een intacte radiale gliale steiger, die gebruikt wordtD door radicale migratie van corticale neuronen. </li><li> Breng het membraaninzetstuk over met een schijfje, dat is geselecteerd voor time-lapse beeldvorming, in een 50 mm diameter glazen bodemschotel met 2 ml slice culture medium met behulp van pincet. Plaats de schotel in de klimaatkamer van de confocale microscoop. </li><li> Stel de resolutie in op 512 bij 512 pixels en verhoog de scansnelheid van 400 Hz tot 700 Hz om de beeldsnelheid te verhogen van respectievelijk 1,4 tot ongeveer 2,5 beelden per seconde. Gebruik maximaal twee keer gemiddeld. Definieer een z-stapel door het elektroporiseerde gebied (meestal 400-100 μm) met een stapgrootte van 1,5 μm. Collectief, deze instellingen zorgen voor een voldoende resolutie en helderheid van het beeld, terwijl fotodamage laag blijft tijdens de acquisitie. Begin de time-lapse-serie door elke 30 minuten een z-stack te nemen. Opmerking: Langdurige blootstelling van het segment aan laserlicht zal fotodamage veroorzaken waardoor de levensvatbaarheid van de cellen wordt verminderd. Pas de expOsure tijd aan laserlicht dienovereenkomstig. </li><li> Analyseer time-lapse-serie met behulp van ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/iij/) of gelijkwaardig. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).</li>
<li>Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+co-regulation+of+neuronal+migration+and+laminar+identity+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex.</a> Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>LoTurco, J. J., Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multipolar+stage+and+disruptions+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The multipolar stage and disruptions in neuronal migration.</a> Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).</li>
<li>Tabata, H., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+mechanisms+of+neuronal+migration+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation.</a> Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).</li>
<li>Wiegreffe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11a+%28Ctip1%29+Controls+Migration+of+Cortical+Projection+Neurons+through+Regulation+of+Sema3c%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c.</a> Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).</li>
<li>John, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11a+is+required+for+neuronal+morphogenesis+and+sensory+circuit+formation+in+dorsal+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development.</a> Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), pl9(2002).</li>
<li>Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+logic+of+neocortical+projection+neuron+specification%2C+development+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-selective+electroporation+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subtype-selective electroporation of cortical interneurons.</a> J Vis Exp. (90), e51518(2014).</li>
<li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+electroporation+and+organotypic+slice+culture+of+mouse+hippocampal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+of+Bcl11b%2FCtip2+in+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).</li>
<li>Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dose-dependent+cortical+neuronal+migration+and+neurite+extension+defects+in+Lis1+and+Ndel1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice.</a> J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).</li>
<li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).</li>
<li>Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+analyzing+neuronal+progenitor+development+and+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).</li>
<li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).</li>
<li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trekking+across+the+brain%3A+the+journey+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-43 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Radiale migratie is een sleutelproces in de ontwikkeling van neocortex. Mutaties in genen die verschillende stappen van dit proces beïnvloeden, kunnen ernstige corticale misvormingen veroorzaken, waaronder lissencephalie en white matter heterotopia 1 , 2 . We hebben onlangs aangetoond dat Bcl11a, die uitgedrukt wordt in jonge migrerende corticale projectie-neuronen, een rol speelt in radiale migratie. Wij gebruiken confocal beeldvorming van migrerende neuronen i...

De neocortex is de belangrijkste site van cognitieve, emotionele en sensorimotorische functies. Het bestaat uit zes horizontale lagen die parallel zijn aan het oppervlak van de hersenen. Tijdens de ontwikkeling geven stamcellen in de laterale wand van de dorsale telencephalon aanleiding tot projectie-neuronen die radiaal migreren naar het paleoppervlak en een lagertype-specifieke neuronale identiteit verwerven. Na het ontstaan ​​in de ventriculaire / subventriculaire zones (VZ / SVZ) worden deze neuronen transient multipolair en vertragen hun migratie. Na een kort verblijf in de intermediaire zone (IZ) veranderen ze naar een bipolaire morfologie, bevestigen aan het radiale gliale steiger en gaan radiaal georiënteerde migratie in de corticale plaat (CP). Bij het bereiken van hun uiteindelijke doelprojectie ontlopen neuronen van de radiale gliale processen en verwerven ze lagenspecifieke identiteit. Mutaties in genen die verschillende stappen van neuronale migratie beïnvloeden, kunnen ernstige corticale misvorming veroorzaken, zoals lissencEphalie of witte stof heterotopia 1 , 2 . In utero electroporation is een snelle en krachtige techniek om neurale voorloper cellen te transfecteren in de ontwikkelende hersenen van knaagdier embryo&#39;s 3 , 4 . Met deze techniek is het mogelijk om genen van belang te knockdown en / of overexpresseren om hun functies te bestuderen bij het ontwikkelen van neuronen. Deze methode heeft specifiek geholpen om de morfologische details te beschrijven en de moleculaire mechanismen van het radiale migratieproces 5 , 6 , 7 , 8 , 9 te karakteriseren. Radiaal migrerende neuronen ondergaan dynamische veranderingen in celvorm, migratiesnelheid, en migrerende richting, die over de tijd directe en continue observatie vereisen. Organotypische plakcultusRe- en time-lapse confocal beeldvorming van elektroporate hersenen maken het mogelijk om migrerende neuronen direct in de gaten te houden. Met behulp van deze gecombineerde aanpak is het mogelijk om verschillende kenmerken van migrerende neuronen te analyseren die niet in vaste weefselsecties van elektroporate hersenen kunnen worden onderzocht. We hebben onlangs confocale beeldvorming van migrerende neuronen toegepast in snijculturen van elektroporeerde hersenen, om de rol van de transcriptiefactor B-cel CLL / lymfoom 11a (Bcl11a) tijdens de corticale ontwikkeling 10 te bestuderen. Bcl11a wordt uitgedrukt in jonge migrerende corticale neuronen en we gebruikten een conditional mutant Bcl11a allele ( Bcl11a flox ) 11 om zijn functies te bestuderen. Elektroporatie van Cre recombinase samen met groen fluorescerend eiwit (GFP) in corticale stamvaten van Bcl11a flox / flox hersenen liet ons een mozaïekmutante situatie creëren, waarbij slechts enkele cellen gemuteerd zijn in eenAnders wildtype achtergrond. Op deze manier was het mogelijk om cel-autonome functies van Bcl11a op het enkele celniveau te bestuderen. We vonden dat Bcl11a mutante neuronen een verminderde snelheid laten zien, hun snelheidsprofielen veranderen, evenals willekeurige oriëntatieveranderingen tijdens hun migratie 10 . In het geschetste protocol beschrijven wij een workflow voor succesvolle elektroporatie en slice cultuurvoorbereiding 12 van muishersenen, evenals conflicterende confocal imaging van corticale slice culturen.

<table><tbody><tr><td>isofluraan</td><td>Abbott Laboratories&nbsp;</td><td>506949</td><td>Forene</td></tr><tr><td>6-wellsplaat</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12-wellsplaat</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>niet-absorbeerbare chirurgische hechting</td><td>Ethicon</td><td>K890H</td><td>3/8 cirkel, 13 mm, taps toelopende punt</td></tr><tr><td>Micro Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td>geribbeld, lengte: 12 cm</td></tr><tr><td>fijne schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td>zijdelings gebogen, lengte: 9 cm</td></tr><tr><td>Mathieu Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12510-14</td><td>wolfraamcarbide, lengte: 14 cm</td></tr><tr><td>fijne pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>recht, 11 cm</td></tr><tr><td>Vannas Tübingen Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td>naar boven gebogen, 9,5 cm</td></tr><tr><td>ringpincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td>OD: 3mm, ID, 2,2 mm, lengte: 9 cm</td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Gibco</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>paardenserum</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>borosilicaat glas capillairen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm</td></tr><tr><td>anesthesie systeem</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6471</td><td></td></tr><tr><td>anesthesiekamer</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0460</td><td></td></tr><tr><td>fluosorber filterbus</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0415</td><td></td></tr><tr><td>low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>vibrerende mes microtome</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>fluorescentie stereo microscoop</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>stereo microscoop</td><td>Leica</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>invertede fluorescentie weefselkweek microscoop</td><td>Leica</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>confocale laserscanning microscoop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5II</td><td></td></tr><tr><td>hybride detector</td><td>Leica</td><td>HyD</td><td></td></tr><tr><td>objectief, 40x/0.60 NA</td><td>Leica</td><td>11506201</td><td></td></tr><tr><td>microscoop temperatuur controle systeem</td><td>Life Imaging Services</td><td>Cube, Brick &amp; Box</td><td></td></tr><tr><td>celkweek inzet</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td>gebruik 38&deg; hoek voor afschuimen</td></tr><tr><td>microinjector</td><td>Parker Hannifin&nbsp;</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III</td></tr><tr><td>carprofen</td><td>Pfizer Animal Health</td><td>NDC 61106-8507</td><td>Rimadyl</td></tr><tr><td>inbedding mal</td><td>Polysciences</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>endotoxin-vrije plasmide maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>laminine</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>magnesiumsulfaat</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>natriumbicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>vierkantgolf electroporator</td><td>Sonidel</td><td>CUY21EDIT</td><td></td></tr><tr><td>pincet met 5 mm platina schijfelektroden</td><td>Sonidel</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>micropipet puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>box filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>FB255B</td><td>2,5 mm x 2,5 mm</td></tr><tr><td>micro-lepel spatel</td><td>VWR</td><td>231-0191</td><td>185 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>schaal met glazen bodem, 50 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse confocal imaging van migreren neuronen in organotypische slice cultuur van embryonale muishersenen met behulp van<em&gt; in utero</em&gt; elektroporatie

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is een snelle en krachtige aanpak om het proces van radiale migratie in de hersencortex van het ontwikkelen van muisembryo&#39;s te bestuderen. Het heeft geholpen om de verschillende stappen van radiale migratie te beschrijven en de moleculaire mechanismen die dit proces beheersen, te karakteriseren. Om migrerende neuronen direct en dynamisch te analyseren, moeten ze in de loop der tijd worden opgespoord. Dit protocol beschrijft een workflow die combineren in utero- elektroporatie met organotypische snijcultuur en tijdverloop confocal beeldvorming, waarmee een direct onderzoek en dynamische analyse van radiaal migrerende corticale neuronen mogelijk is. Bovendien is gedetailleerde karakterisering van migrerende neuronen, zoals migratiesnelheid, snelprofielen, alsmede radiale oriëntatieveranderingen, mogelijk. De methode kan gemakkelijk worden aangepast om functionele analyses van genen van belang in radiaal migrerende corticale neuronen uit te voeren door verlies en winst van functie, alsmede reddingsexperimenten. Time-lapseBeeldvorming van migrerende neuronen is een state-of-the-art techniek die ooit opgericht is een krachtig instrument om de ontwikkeling van de hersencortex in muismodellen van neuronale migratiestoornissen te bestuderen.

Voorheen hebben we aangetoond dat genetische deletie van Bcl11a door middel van utero elektroporatie de radiale migratie van late geboren bovenlaagse projectie neuronen 10 verstoort. Elektroporatie van een DNA - plasmidvector die Cre-IRES-GFP bevat efficiënt verwijderd Bcl11a in conditional Bcl11a flox / flox brains 11 . Bij het analyseren van E14.5 elektroporate hers...

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Het algemene doel van deze procedure is om radiaal migrerende neuronen in organotypische plakculturen, bereid uit geëlektroporeerd embryonaal brein, direct te observeren middels time-lapse confocale microscopie. Deze methode kan helpen bij het bestuderen van cruciale aspecten van de ontwikkeling van de neocortex. Het maakt onderzoek mogelijk naar de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de polarisatie van neuronen en de radiale migratie van neuronen naar hun uiteindelijke positie binnen de hersenen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de dynamische eigenschappen van migrerende neuronen geanalyseerd kunnen worden, waaronder snelheidsprofielen, de gemiddelde migratiesnelheid en veranderingen in de migratierichting. Begin met het plaatsen van een correct geanestheseerde zwangere muis in rugligging op een warmteplaat. Controleer op de afwezigheid van de pedaalreflex.Dek vervolgens de ogen zorgvuldig af met vaseline om uitdroging te voorkomen. Verspreid daarna voorzichtig de ledematen en fixeer deze met chirurgische tape aan de verwarmingsplaat. Steriliseer de buik door deze af te nemen met 70%ethanol gevolgd door een jodiumoplossing, en plaats vervolgens steriel

time-lapse-confocal-imaging-migrating-neurons-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo's voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.

Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo&#39;s voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

We beschrijven een protocol voor real-time videoimaging van neuronale migratie in de muis voorhersenen. De migratie van viraal gemerkte of geënte neuronale precursors opgenomen in acute levende plakjes met breedveld fluorescerende beeldvorming met een relatief snelle verwerving interval de verschillende fasen van celmigratie, zoals de duur van de stationaire en migratiefasen en de snelheid van bestuderen migratie.

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) This video demonstrates time-lapse confocal microscopy to observe cortical neuron radial migration from the subventricular zone to the cortical plate via radial glial scaffolds in transduced mouse embryonic brain slices.

Time-Lapse Imaging of Cortical Neuron Radial Migration in Transduced Mouse Embryonic Brain Slices

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Hier presenteren we een protocol dat een hulpmiddel biedt om regulerende mechanismen van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van de hippocampus te onderzoeken. Het gebruik van ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur maakt de op- en neerregulatie van de expressie van genen van belang in enkele cellen mogelijk en volgt hun lot tijdens de ontwikkeling.

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer tijd-afbeelding confocale microscopie van migrerende neuronen in organotypische snijcultuur van embryonale muizenhersenen met in utero elektroporatie. Deze methode onthult moleculaire mechanismen van neuronpolarisatie en migratie tijdens neocorticale ontwikkeling.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van In Utero Elektroporatie (Video) | JoVE Journal

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van

Meer video's verkennen