染色质免疫沉淀（ChIP）在小鼠T细胞系

该方案的总体目标是在合理的时间内以高重现性在小鼠 T 细胞系中高效进行染色质免疫沉淀，以研究组蛋白标记在特定基因组区域的分布。这种方法可以帮助回答染色质生物学领域的关键问题，特别关注 T 细胞，例如在 T 细胞分裂或激活过程中如何调节染色质结构。该技术的主要优点是染色质剪切高效且可重复性高。

这种方法的视觉演示至关重要，因为染色质剪切条件难以确定，因为苯酚-氯仿异戊醇步骤可能具有挑战性。演示该程序的是我们实验室的博士生 Francesca Ferrante。第一天，将小鼠 T 细胞从 6 孔板转移到 50 mL 试管中。

然后将细胞在 24 摄氏度下以大约 271 倍 G 离心 5 分钟，将细胞沉淀重悬于 30 mL IMDM 细胞培养基中后，使用 Neubauer 腔室对细胞进行计数。将 2000 万个细胞的等分试样收集到新的 50 mL 试管中。然后将甲醛直接加入细胞培养基中，达到 1% 的最终浓度，并在室温下孵育 10 分钟。

接下来加入 1/8 体积的 1 摩尔甘氨酸 pH 7.5，并在室温下孵育 5 分钟。在 24 摄氏度和大约 271 倍 G 下离心 5 分钟，使细胞沉淀，然后通过将细胞沉淀重悬于 10 毫升磷酸盐缓冲盐水中并重复离心来洗涤细胞。用 1 毫升 PBS 再次洗涤细胞。

前将重悬的细胞转移到 1.5 mL 试管中。染色质的剪切是最关键的步骤，取决于细胞、剪切管、装置和裂解缓冲液的数量以及剪切参数。洗涤后，将细胞沉淀重悬于 1 mL SGS 裂解缓冲液中，并在冰上孵育。

10 分钟后，将每个样品转移至超声管中。然后根据文本协议中指示的设置使用聚焦超声波仪进行剪切。剪切后，将样品转移到 1.5 毫升试管中。

在 4 摄氏度和大约 18， 000 倍 G 下离心 10 分钟，然后将上清液转移到新试管中。收集 50 微升用于测定剪切效率，并在液氮中快速冷冻剪切裂解物。将裂解物分装在零下 80 摄氏度下储存。

为了确定剪切效率，首先向 50 μL 的剪切裂解物中加入 50 μL 洗脱缓冲液。将混合物在 65 摄氏度下摇动孵育过夜。第二天，向样品中加入 100 μL TE 缓冲液和 4 μL 10 mg/ml Rnase A。

混合样品，在 37 摄氏度下振荡孵育 2 小时。然后向每个样品中加入 2 微升每毫升 20 毫克的蛋白酶 K，然后在 55 摄氏度下振荡孵育 2 小时。接下来，将每个样品转移到适用于苯酚氯仿异戊醇提取的凝胶管中。

根据制造商的说明处理管子。加入 200 微升苯酚氯仿异戊醇并摇动试管。离心后，将上层相转移到新管中。

重复此过程一次。根据制造商的说明，使用纯化柱纯化 DNA，但要洗涤膜两次。最后一次洗涤后，在室温下将试管打开两分钟以蒸发残留的乙醇。

洗脱时，向色谱柱中加入 50 μL 水，并在室温下孵育 1 分钟。然后旋转试管 1 秒钟以适当润湿膜。在室温下孵育膜 1 分钟，然后离心洗脱 DNA。

根据制造商的说明，使用高灵敏度试剂盒在荧光计上定量纯化的 DNA。最后，在 1.8% 琼脂糖凝胶上分析大约 500 ng 纯化的 DNA。以及使用高灵敏度试剂盒在电泳系统上获得大约 1 ng 纯化的 DNA。

第 3 天，用 5 体积的稀释缓冲液稀释 1 体积的剪切裂解物。在冷藏室中旋转时，用每毫升 30 μL 蛋白 A 琼脂糖珠预澄清稀释的裂解物 30 分钟。将样品在 4 摄氏度下以大约 750 倍的离心力离心 5 分钟，收集 10% 的澄清液作为输入样品，并将其储存在 4 摄氏度下。

接下来，将所需量的澄清液分装到新试管中。然后将所选抗体添加到每个试管中，并在 4 摄氏度下旋转过夜。第 4 天，加入 40 μL 蛋白 A 珠子。

时，在 4 摄氏度下孵育混合物 1 小时。用 1 毫升低盐缓冲液洗涤磁珠，在 4 摄氏度下孵育 5 分钟，同时旋转。然后在 4 摄氏度和大约 950 倍 G 下离心 3 分钟，用高盐缓冲液、氯化锂缓冲液和 TE 缓冲液重复洗涤。

然后向样品中加入 110 μL 洗脱缓冲液。在室温下孵育 15 分钟，每 2 分钟涡旋一次样品。再次离心后，将 100 μL 上清液转移到新的 1.5 mL试管中。

用 100 μL 洗脱缓冲液重复洗脱，并混合洗脱液。同时，将洗脱缓冲液添加到先前收集的输入样品中，以达到 200 μL 的最终体积。将所有样品在 65 摄氏度下振荡孵育过夜。

第 5 天，向每个洗脱液中加入 200 微升 TE 缓冲液，并加入 8 微升每毫升 10 毫克的 Rnase A.混合样品，然后在 37 摄氏度下振荡孵育 2 小时。然后向每个洗脱液中加入 4 微升每毫升 20 毫克蛋白酶 K，然后在 55 摄氏度下振荡孵育 2 小时。接下来，将每个样品转移到适用于苯酚氯仿异戊醇提取的凝胶管中。

加入 400 微升苯酚氯仿异戊醇并摇动试管。离心管后，将上层相转移到新管中，并重复此过程一次。最后，像以前一样使用纯化柱纯化 DNA。

小鼠 T 细胞系剪切的这一代表性结果表明染色质的有效碎裂。此处显示的是小鼠 T 细胞系中具有代表性的染色质免疫沉淀实验。持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子高度富集组蛋白 3 上赖氨酸 4 的三甲基化。

以及组蛋白 3 上的赖氨酸 27 乙酰化。但不适用于组蛋白 3 上赖氨酸 4 的单甲基化。相反，失活基因 deltex-1 的增强子高度富集组蛋白 3 上赖氨酸 4 的单甲基化。

但组蛋白 3 上赖氨酸 4 的三甲基化富集度很差。以及组蛋白 3 上的赖氨酸 27 乙酰化。在尝试此程序时，请务必记住在剪切样品之前解决 SGS 沉淀物。

我们在研究基因调控 T 细胞时首先有了这种方法的想法。我们选择 T 细胞是因为它们与医学应用高度相关，并且代表了研究高等真核生物基因表达的最佳模型系统之一。经过开发，这项技术为染色质生物学领域的研究人员探索哺乳动物系统中的染色质调节铺平了道路。

该技术的意义延伸到 T 细胞相关疾病的治疗，因为它允许解剖 T 细胞基因表达程序的建立和调节。不要忘记，使用甲醛、苯酚氯仿和异戊醇非常严重，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在通风橱下工作和佩戴适当的防护设备。虽然这种方法可以提供对小鼠 T 细胞染色质调控的见解，但它也可以应用于其他系统，例如内皮细胞和肺细胞系。