Semi-automatique de criblage de bibliothèques d’affichage bactérienne pour Peptide affinité réactif découverte et l’analyse d’isolats qui en résulte

Les objectifs globaux de cette procédure de bio-panning sont d’isoler rapidement les agents de capture peptidique d’une cible protéique spécifique d’intérêt et d’éliminer rapidement et efficacement les candidats non spécifiques d’une analyse ultérieure en aval. Cette méthode peut être utilisée pour la découverte de réactifs d’affinité peptidique robustes pour une variété d’applications, de la détection de menaces biologiques au diagnostic de maladies. Le principal avantage de cette technique est que les réactifs d’affinité peptidique peuvent être rapidement isolés en une semaine environ sans formation importante.

Bien que cette méthode puisse être utilisée pour découvrir des réactifs d’affinité peptidique pour une utilisation hors cellule, les peptides pourraient également être utilisés comme matériaux vivants. En général, l’aspect le plus difficile pour les personnes novices dans cette méthode sera l’analyse de la séquence en aval des candidats, qui interagit fortement avec les protocoles expérimentaux présentés ici. Le bio-panoramique des bibliothèques d’affichage bactérien est un processus cyclique qui commence par un tri négatif par rapport aux billes magnétiques elles-mêmes afin d’éliminer tout liant non spécifique au matériau de la bille ou toute protéine de capture attachée.

La fraction négative qui ne lie pas les billes magnétiques doit être conservée. Un tri négatif supplémentaire peut être effectué contre toute cible protéique potentielle à réaction croisée, et la fraction négative qui ne se lie pas aux billes magnétiques est à nouveau conservée. Les étapes de tri positif ultérieures sont très similaires au tri négatif contre une cible protéique, mais cette fois-ci, la fraction positive liée aux billes magnétiques est conservée.

Pour un tri positif de la bibliothèque d’affichage bactérien, inoculez d’abord 500 millilitres de Luria Broth Miller complété par du chloramphénicol, ou LBCM-25, avec environ une fois 10 à 11e cellules d’une bibliothèque de tri d’affichage bactérien diversifiée pré-appauvrie de peptides indésirables par tri négatif. Incuber la bibliothèque à 37 degrés Celsius en 225 tr/min jusqu’à ce que la culture atteigne une OD 600 de 0,5 à 0,55. Ensuite, induisez l’expression peptidique avec 0,04 % L-arabinose pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius en secouant.

À la fin de la période d’induction, placez la culture sur de la glace. Et collecter deux fois dix à la onzième cellules bactériennes par centrifugation. Remettez le granulé en suspension dans 1,5 millilitre de PBS en le remuant doucement.

Et divisez les bactéries en plusieurs micro-tubes à centrifuger si nécessaire pour une deuxième centrifugation. Remettre la pastille en suspension dans un millilitre de PBS complété par la cible de biotinylation d’intérêt pour une incubation de 45 minutes à quatre degrés Celsius sur une plate-forme rotative. Pendant ce temps, lavez 100 microlitres de billes codées à la streptavidine dans un millimètre de PBS complété par de l’albumine sérique bovine, ou BSA, par centrifugation.

Placez les billes lavées dans un séparateur de particules magnétiques de paillasse et retirez soigneusement le super nadent, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. À la fin de l’incubation rotative, centrifugez les cellules pour collecter toute cible non liée dans le super nadent et remettez en suspension la pastille de cellules bactériennes liée aux protéines cibles dans un millilitre de PBS plus BSA. Utilisez tout le volume de cellules bactériennes pour remettre la bille en suspension.

Incuber à quatre degrés Celsius sur une plate-forme rotative pendant 30 minutes. Placez ensuite la solution de perles et de bactéries sur de la glace. Allumez l’instrument auto max pour initialiser le système et sélectionnez laver maintenant, rincer et exécuter dans le menu de séparation pour amorcer les lignes avec les tampons de lavage et d’exécution du fabricant, respectivement.

À la fin du lavage, amorcez les lignes une fois de plus à l’aide d’un tampon PBS plus BSA. Lorsque l’instrument est prêt, transférez le mélange de bactéries et de billes dans un tube conique de 15 millilitres et rincez le tube avec 500 microlitres supplémentaires de PBS frais plus BSA. Tirez le lavage avec le mélange de bactéries et de billes et placez le tube dans la fente d’échantillonnage d’un support de tube conique à quatre degrés Celsius.

Placez des tubes de collecte vides de 15 millilitres dans les fentes de sélection positive et négative du rack et transférez le rack sur la plate-forme de l’instrument. Attribuez un programme de séparation à chaque échantillon sur le support en ajoutant une étape de rinçage entre chaque échantillon et après le dernier échantillon. Sélectionnez Exécuter pour démarrer la séparation des cellules et OK ou continuer pour confirmer que suffisamment de mémoire tampon est disponible.

Lorsque le programme est terminé, retirez le support et placez la fraction positive contenant à la fois les bactéries et les billes sur de la glace. Après avoir amorcé les conduites comme nous venons de le démontrer, avec les tampons de rodage et de lavage du fabricant, sélectionnez l’alimentation et oui pour arrêter l’instrument et confirmer qu’il y a 70 % d’éthanol dans la bouteille de solution de stockage pour la décontamination. Lorsque l’arrêt du système est terminé, les bouteilles seront violettes.

La machine peut être éteinte. Ensuite, utilisez toute la fraction de tri positif pour inoculer un litre de LBCM25 complété par du glucose D pour une culture nocturne à 37 degrés Celsius en secouant. Pour analyser le succès de l’isolement du réactif d’affinité après chaque cycle de tri, à la fin de l’induction peptidique post-tri, ajoutez cinq microlitres de cellules induites à 25 microlitres de solutions comme indiqué dans le tableau.

Après une incubation de 45 minutes sur de la glace, recueillir les bactéries dans chaque solution par centrifugation et aspirer le super nadent de chaque échantillon. Avec les tubes d’échantillon sur la glace, sélectionnez administrateur sur le logiciel de l’instrument FAX et ouvrez le dossier d’analyse approprié. Cliquez sur Nouveau test.

Cliquez ensuite avec le bouton droit de la souris pour renommer l’expérience, puis cliquez sur Feuilles de calcul globales. Cliquez sur l’icône du graphique à points dans la feuille de calcul globale pour créer un nouveau nuage de points. Sélectionnez ensuite le graphique à points lui-même et sélectionnez l’icône de l’inspecteur.

Cliquez sur les cases en regard des axes X et Y dans la fenêtre ouverte pour ajuster les axes à un affichage bi-exponentiel et fermer la fenêtre de l’inspecteur. Cliquez sur l’expérience et créez un nouvel échantillon, en cliquant avec le bouton droit de la souris pour renommer l’échantillon selon l’expérience. Cliquez ensuite sur le signe plus pour agrandir l’échantillon et renommer l’échantillon.

Pour analyser un échantillon de contrôle négatif, remplacez la pastille PBS uniquement en suspension dans 500 microlitres de tampon de coulée FAX glacé, en mélangeant bien par pipetage. Transférez l’échantillon dans un tube FAX, en effleurant pour maintenir les cellules en solution, et chargez l’échantillon dans le tube d’injection d’échantillon ou SIT de l’instrument. Double-cliquez sur le tube d’échantillon actuel et cliquez sur les données acquises.

Affichez ensuite les événements dans le graphique à points de la zone de diffusion latérale par rapport à la zone de diffusion vers l’avant préparé précédemment, en ajustant le seuil de tension du tube photomultiplicateur sous l’onglet de seuil si nécessaire afin que les cellules de contrôle négatives tombent près du centre. Lorsque l’échantillon est correctement lu, ajustez le débit pour afficher 200 à 2 000 événements par seconde et cliquez sur Enregistrer les données pour capturer un minimum de 10 000 événements. Lorsque tous les événements ont été acquis, retirez le tube d’échantillon du SIT.

Sélectionnez l’icône de porte polygonale et dessinez une porte autour de la majorité de la population de cellules dans le nuage de points. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le graphique à points pour sélectionner Afficher la hiérarchie de la population, puis cliquez sur P1 dans la hiérarchie de la population et créez un nouveau graphique à points pour afficher la population P1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur chaque axe pour changer l’axe Y en zone FITC et l’axe X pour avancer la zone de diffusion et ajustez les axes en un affichage bi-exponentiel.

Utilisez la porte polygonale pour bloquer les cellules de contrôle négatif aussi étroitement que possible autour des côtés supérieur et gauche de la population, et sélectionnez P2 dans la hiérarchie de la population, en cliquant avec le bouton droit pour sélectionner Inverser la porte. Moins de 1 % de la population devrait être exclue. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le graphique à points avec la porte P2 pour sélectionner afficher les populations et sélectionnez les populations P2 et non P2 à afficher.

Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le graphique à points avec la porte P2 pour sélectionner Créer une vue de statistiques et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la fenêtre de la vue de statistiques pour sélectionner Modifier la vue de statistiques. Sous l’onglet Populations, ajoutez ou supprimez les populations selon le cas, y compris la population parente P1. P2 et non P2 devrait déjà être affiché.

Ensuite, sous l’onglet statistiques, ajoutez le support de la zone FITC et toute autre statistique d’intérêt et cliquez sur OK pour fermer la fenêtre. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le nuage de points P2 et sélectionnez Dupliquer pour créer un graphique à points similaire pour la zone PE par rapport à la zone FSC. Ajustez l’axe des Y et utilisez l’échantillon PBS seul pour contrôler la population P3.

Ensuite, retournez la porte. Et afficher les populations appropriées. Une fois que toutes les portes appropriées ont été définies, utilisez la feuille de calcul pour exécuter tous les échantillons, en enregistrant environ 10 000 événements par tube.

Comme dans cette expérience représentative, la liaison d’Ypet Mona à un peptide de contrôle positif fixe peut aider à surveiller le niveau d’expression de la bibliothèque de peptides induits au sein de la population. Les cellules dépourvues de peptides affichés en surface sont généralement éliminées pendant le processus de tri, comme observé dans les troisième et quatrième tours. L’enrichissement de la bibliothèque de peptides se liant à la cible d’intérêt spécifique est généralement réalisé en trois tours de tri positif.

Passer à un quatrième tour de tri peut être bénéfique, car les séquences peptidiques de plus haute affinité déjà présentes au troisième tour sont susceptibles d’être encore enrichies au quatrième tour, ce qui facilite la sélection des candidats potentiels. La spécificité est évaluée en comparant la liaison à la cible visée à la liaison à toute cible potentielle à réaction croisée, telle que celles qui ont été utilisées pour le tri négatif. L’analyse des séquences du quatrième tour de tri révèle généralement des séquences répétitives qui sont d’excellents points de départ pour les analyses d’affinité et de spécificité.

L’analyse de l’alignement des séquences répétitives peut être utilisée pour révéler la présence d’une séquence consensuelle qui peut aider à la sélection des candidats. Une colonie représentative de chaque séquence répétitive peut ensuite être analysée plus en détail par des faits d’affinité et de spécificité sur la cellule afin d’évaluer la liaison peptidique aux protéines réactives cibles et croisées. Une fois maîtrisée, une expérience biologique complète avec l’analyse initiale d’affinité et de spécificité peut être réalisée en moins de deux semaines si elle est exécutée correctement.

Lors de l’exécution de la procédure complète, il est important de se rappeler que vous devrez peut-être alterner plusieurs fois entre l’évaluation de liaison et l’analyse de séquence pour bien comprendre le transit impliqué dans l’affinité de liaison. Nous incluons un fichier macro supplémentaire que nous avons développé pour automatiser une grande partie de l’analyse des peptides et pour rationaliser davantage la sélection des candidats. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler rapidement les agents de capture peptidique d’une bibliothèque d’affichage bactérien et d’éliminer les candidats non spécifiques d’une analyse ultérieure en aval.

Après avoir suivi cette procédure, d’autres méthodes telles que ALIZA peuvent être effectuées pour confirmer l’affinité et la spécificité de liaison hors cellule.