כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לכמת את השפע ורמות הטעינה של RNA העברה ב-Escherichia coli. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התא כגון, כיצד רמות טעינת tRNA משתנות במצבי גידול שונים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שניתן להשוות כמותית את רמות הרנ"א גם בין מצבי גידול המשנים באופן דרסטי את הרכב הרנ"א בתאים.

התחל את הניסוי הזה על ידי גידול תרביות E.coli ניסיוניות ועלייה חדה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. גדל את תרבית הספייק אין ב-37 מעלות צלזיוס, תוך טלטול ב-160 סל"ד. כאשר תרבית הספייק אין הגיעה ל-OD436 של כ-0.1, גרמו לביטוי של תא tRNA C על ידי הוספת IPTG.

גדל את התרבות עד שהיא מגיעה ל- OD436 של כ- 0.5. לאחר מכן, העבירו את התרבית לקרח עד שכל הדגימות נאספו. לאחר מכן, יש לחמם מראש בקבוק תרבית אחד מכוסה של 100 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של 10% TCA לכל דגימה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

מדוד ורשום את ה-OD436 של תרביות הניסוי ישירות לפני קצירת התאים. לאחר מכן, העבירו ארבעה מיליליטר תרבית לבקבוק TCA שחומם מראש. מערבבים את הדגימה ביד תוך סיבוב הבקבוק למשך חמש שניות, מה שישבית מיד את כל הפעילויות האנזימטיות השומרות על רמות הטעינה של ה-tRNAs.

לאחר איסוף כל הדגימות, הוסף 5% תאים עם ספייק אין לכל דגימה. הכן גם דגימת בקרה המורכבת רק מתאי ספייק אין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל במיצוי RNA, שפכו שמונה מיליליטר מכל דגימה, כולל בקרות לתוך צינור צנטריפוגה מקורר קרח.

צנטריפוגה את הדגימות ב-9, 500 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט לחלוטין, השעו מחדש את הגלולה ב-0.3 מיליליטר נתרן אצטט קר, המכיל 10 מילילימולרי EDTA. העבירו כל דגימות לצינור מיקרו-צנטריפוגה קר של 1.5 מיליליטר והוסיפו 0.3 מיליליטר פנול מאוזן עם המאגר, המשמש להשעיה מחדש של הגלולה.

לאחר מכן, מערבולת כל דגימה 10 פעמים למשך 15 שניות בכל פעם. עם לפחות דקה אחת באפס מעלות צלזיוס בין כל מערבולת, כדי לשמור על הדגימות קרות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-20,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

העבירו את החלק העליון או פני המים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר. הוסף 0.3 מיליליטר פנול קר לפני המים ומערבל את הדגימות ארבע פעמים 15 שניות כל אחת כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-20,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

העבירו את פני המים לצינור מיקרו-צנטריפוגה קר חדש של 1.5 מיליליטר והוסיפו 2.5 נפחים של אתנול 96% קר. לאחר מכן, דגרו על הצינורות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לזרז את ה-RNA. צנטריפוגה של הדגימות ב-20,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסיפו בזהירות מיליליטר אחד של אתנול קר 70% לכדור ה-RNA, והקפידו לא להפריע לו. הפוך את הצינור בעדינות פעם אחת, כדי לשטוף אותו באתנול. לבסוף, צנטריפוגה ב 20, 000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

הסר את הסופרנטנט לחלוטין, וייבש את הכדור באוויר עד להסרת האתנול לחלוטין. ב-20 מיקרוליטר של נתרן אצטט קר המכיל 1 מילי-מולרי EDTA, מערבולת נמרצת כדי להשהות מחדש את הגלולה. כדי להתחיל באלקטרופורזה, מערבבים ארבעה מיקרוליטר מכל דגימה עם שישה מיקרוליטרים של מאגר טעינה.

טען את הדגימות כולל בקרות על ג'ל פוליאקרילאמיד 6.5 בעובי 0.4 מילימטר המכיל שמונה מאגר אוריל מולרי ו-0.1 מולארי נתרן אצטט. לאחר מכן, הפרד את ה-RNA על ידי הפעלת האלקטרופורזה ב-10 וולט לסנטימטר ג'ל בארבע מעלות צלזיוס למשך כ-20 שעות עד שהצבע הכחול ברומופנול מגיע לתחתית הג'ל. הפרד בזהירות את שתי לוחות הזכוכית כך שהג'ל יישאר על אחת מהן.

השתמש באזור הג'ל מצבע הקסילן ציאנול ו-20 סנטימטרים למטה לכיוון צבע הברומופנול לספיגה. חותכים פיסת נייר סינון דקה לגודל אזור הספיגה הרצוי. הניחו את נייר הסינון על גבי החלק של הג'ל שישמש לספיגה.

חותכים וזורקים את חלקי הג'ל שאינם מכוסים בנייר פילטר. לאחר מכן השתמש בנייר הסינון כדי להרים בזהירות את הג'ל הרחק מצלחת הזכוכית. הנח קרום ניילון טעון חיובי על גבי הג'ל, ושטף אותו במאגר העברה ב-20 וולט למשך 90 דקות.

סיים על ידי קישור צולב של ה-RNA לממברנה באמצעות אור UV. לאחר מכן, הניחו את הממברנה הצולבת בצינור הכלאה והוסיפו שישה מיליליטר של תמיסת הכלאה. סובב את הצינור בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי להכליא מראש את הממברנה.

לאחר מכן, הוסף 30 בדיקת DNA אוליגו רדיואקטיבי טוחנת שיא מולארית, חמישה ראשוניים ומסומנים ב-P32. סובב כדי לדגור את הממברנה עם הגשושית בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה חד פעמית של 10 מיליליטר כדי להסיר את הבדיקה.

לאחר מכן, יש לשטוף במהירות את הממברנה פעמיים בצינור ההכלאה, ב -15 מיליליטר תמיסת כביסה בטמפרטורת החדר. העבירו את הממברנה למיכל פלסטיק שטוח, כסו אותה בתמיסת הכביסה וסגרו את המכסה. דגרו את הממברנה על שייקר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

החלף את התמיסה והמשיך לכבס עד להשגת יחס אות לרעש מספק. השתמש בשפופרת גייגר מולר כדי לקבל את יחס האות לרעש, על ידי השוואת הקרינה מהאזור שבו הגשושית עברה הכלאה ל-tRNA, לקרינה מאזור ריק. לאחר מכן, עטפו את הממברנה היטב בניילון נצמד ואטמו אותה אטומה על ידי ריתוך.

הנח את הממברנה הזו על מסך הדמיית זרחן. לאחר זמן חשיפה מתאים, סרוק את המסך באמצעות סורק לייזר ושמור את הקובץ בפורמט ג'ל. לאחר מכן, טען את קובץ הג'ל לתוכנת ההדמיה.

צייר קו אנכי לאורך כל אחד מנתיבי הדגימה כך שהוא משתרע על רוב רוחב הנתיב תוך אי הכללת קצוות הרצועות שבהם האות יכול להיות לא אחיד. כדי להמחיש ספירות מכל נתיב, לחץ על ניתוח ולאחר מכן צור גרף. הגדר ידנית את שתי הפסגות המייצגות את ה-tRNA הטעון והלא טעון מכל נתיב.

לאחר מכן, לחץ על ניתוח ולאחר מכן, דוח שטח כדי לקבל ספירות מכל שיא. לבסוף, רשום את השטח שמתחת לכל אחת משתי הפסגות. חשב את רמות ה-tRNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

שיטה זו שימשה למדידת השפע של tRNAs שונים ו-E.Coli nf915 לפני ובמהלך הרעבת הארגינין שלנו. בחלקה הצפונית ההכלאה עם בדיקות tRNA שונות, יש הפרדה ברורה בין הרצועות המייצגות את המטען tRNA מהרצועות המייצגות את ה-tRNA הלא טעון. פרופיל הקרינה לאורך כל נתיב, התקבל מהכתמים הצפוניים באמצעות תוכנת הדמיה.

אות הקרינה מכל נתיב כומת על ידי בידוד כל אחד מהכתם. גרף המייצג את כימות האות מנתיב בודד, מראה שתי פסגות. הפסגה השמאלית מגיעה מה-tRNA האמינואציל והימנית מה-tRNA המפוזר.

השטח שמתחת לכל פסגה מיוצא לניתוח נוסף. כימות הרצועות מהכתם הצפוני, מראה כי השפע היחסי של כל מיני ה-tRNA שנבדקו ירד במהירות ובאופן משמעותי במהלך רעב חומצות אמינו. מצד שני, רמות טעינת ה-tRNA של הארגינין המקבל tRNA ירדו במהירות עם הסרת הארגינין ולאחר מכן עלו מעט במהלך תקופת הרעב.

עם זאת, רמות הטעינה של ה-tRNA האחרים עלו מעט עם הרעב ואז ירדו כמעט לרמות שלפני הרעב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר RNA באופן שניתן לכמת את טעינת ה-tRNA ואת השפע וכיצד להשתמש בתאי ספייק אין לנורמליזציה. לאורך הליך זה, חשוב לזכור לשמור על ה-RNA קר וחומצי כדי למנוע הידרוליזה של ה-RNA.