Оценка дефекты обструкции мочевыводящих путей Junction Метиленовый синий краситель инъекции

Общая цель данной процедуры заключается в определении обструкций соединений мочевыводящих путей путем введения красителя метиленового синего в почки. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области развития почек и нижних мочевыводящих путей, такие как соединение мочеточника с мочевым пузырем. Основным преимуществом данной методики является то, что она предоставляет простой способ визуализации структуры мочевыводящих путей при массовом развитии, что позволяет проводить анализ развития мочевыделительной системы.

Для начала эксперимента отмерьте 0,1 г порошка метиленового синего. Растворите метиленовый синий в 10 мл 1x фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) и перемешайте смесь на вортексе. Затем профильтруйте полученный раствор метиленового синего с концентрацией 10 мг/мл с помощью шприцевого фильтра, чтобы предотвратить засорение при инъекции.

Затем соберите стерильный набор для венепункции с одноразовым шприцем объемом 3 мл и заполните шприц 3 мл отфильтрованного раствора метиленового синего. Продезинфицируйте диссекционные ножницы и пинцет 70% этанолом. Для сбора перинатальных эмбрионов на стадиях E18.5 или E19.5 сначала проведите эвтаназию беременных мышей путем вдыхания углекислого газа.

Затем проведите вывих шейного позвонка в соответствии с рекомендациями NIH. Далее распылите 70% ethanol на вентральную поверхность живота животного. Затем, используя стерильные диссекционные ножницы и пинцет, вскройте брюшную полость по вентральной стороне.

Аккуратно извлеките матку целиком, отделяя ее от тела в области кончиков рогов матки. Затем промойте всю матку 1x PBS в чашке Петри. Разрежьте матку сегментами с помощью диссекционных ножниц и удалите плацентарную децидуа с помощью диссекционного пинцета, чтобы обнажить эмбрионы и желточные мешки.

Сначала удалите желточный мешок, затем с помощью диссекционных пинцетов удалите амниотическую оболочку, чтобы освободить перинатальные эмбрионы. Обезглавьте эмбрион с помощью диссекционных ножниц. Закрепите эмбрион булавками в положении на спине (вентральной поверхностью вверх) под диссекционным микроскопом, оснащенным цифровой камерой для получения изображений.

Отрежьте хвост для генотипирования. Используя пинцет, осторожно надрежьте кожу, чтобы открыть брюшную полость эмбриона. Затем аккуратно удалите лишние органы и ткани, такие как печень, желудок и кишечник, вырезая или извлекая их пинцетом, чтобы обнажить почки, мочеточники и мочевой пузырь, расположенные дорсально.

Соберите излишки крови из вскрытого эмбриона стерильными марлевыми салфетками, затем переходите к инъекции красителя. Удалите пузырьки воздуха из иглы и трубок, вытесняя раствор метиленового синего из кончика иглы с помощью гидростатического давления. Поднимите шприц с раствором красителя выше уровня кончика иглы, чтобы начать подачу жидкости.

Затем опустите шприц, чтобы остановить поток. Далее введите иглу в почечную лоханку рядом с проксимальным отделом мочеточника, стараясь не сместить ее после установки. Выполните инъекцию красителя в почку, чтобы определить наличие обструкции мочевыводящих путей.

После введения одной иглы в почечную лоханку для успешного проведения данного теста следует ввести вторую иглу в почечную лоханку в направлении мочеточника, избегая прохождения через паренхиму почки или попадания в кровеносный сосуд. Поднимите шприц примерно на 20 сантиметров для создания гидростатического давления и введите от 15 до 16 µL раствора красителя. Затем отслеживайте распространение синего цвета красителя, которое начинается сначала в почечной лоханке, затем по всей длине мочеточника и, наконец, в просвете мочевого пузыря.

Опустите шприц, чтобы остановить поток красителя, и извлеките иглу из почки. Зафиксируйте в лабораторном журнале наличие гидронефроза почки, гидроуретера и конечного положения раствора красителя. Наконец, проведите инъекцию в контралатеральную почку и дайте красителю течь в общей сложности 20 секунд.

Сфотографируйте почку, мочеточник и мочевой пузырь, заполненные раствором красителя, используя камеру и программу для визуализации, подключенные к стереомикроскопу. После введения в одну почку краситель метиленовый синий перемещается из почечной лоханки через мочеточник в мочевой пузырь, в результате чего в просвете мочеточника и мочевого пузыря появляется видимый синий цвет. Более интенсивный синий цвет появляется в просвете мочевого пузыря спустя примерно 20 секунд после введения красителя в обе почки, что указывает на отсутствие обструкции в местах соединения мочевыводящих путей во второй мочевыделительной системе.

При введении красителя в аномально расширенный гидроуретер конечное положение раствора красителя остается неясным. При этом обструкцию мочеточниково-пузырного соединения (МПС) невозможно подтвердить, несмотря на отсутствие красителя в просвете мочевого пузыря, так как аномальный гидроуретер был поврежден в средней части. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости расчета количества красителя для эмбрионов в околоплодном пузыре, чтобы получить целостную мочевыделительную систему.

И удалите пузырьки, чтобы они не препятствовали потоку красителя.