人脐血巨分化与血小板形成的 CD34⁺单元格

该程序的总体目标是使用人脐带血样本分离纯 CD34 阳性细胞，以研究感兴趣的特定药物对巨核细胞分化、血小板前形成和血小板生成的影响。这种方法可以帮助回答巨核细胞和血小板领域的关键问题，例如特定治疗对巨核细胞分化和血小板产生和功能有什么影响。该技术的主要优点是它提供了一种从新鲜脐带血中一致分离活 CD34 阳性细胞的方法。

通过这种方法可以提供对巨核细胞生成症的见解，也可以研究其他细胞类型，如淋巴细胞、红细胞和巨噬细胞。首先，将 10 mL 分离缓冲液加入每 10 mL 脐带血的 150 mL 锥形管中。使用安装在 10 毫升注射器上的 18 号钝针，将 10 毫升血液转移到每根管中，然后在每根管底部添加 15 毫升淋巴细胞分离培养基。

通过密度梯度离心分离细胞，然后在离心结束时，小心地将 5 至 10 毫升含有血沉棕黄层的单核细胞收集到每个样品的一根新管中。用新鲜的分离缓冲液将每管中的总体积增加到 50 mL，然后再次离心细胞。将沉淀重悬于 5 至 10 mL 新鲜分离缓冲液中，并合并细胞样品。

用新鲜的分离缓冲液将体积调节至 50 毫升进行计数，并留出 100 微升细胞，通过流式细胞术测定 CD34 阳性细胞的百分比。再次离心细胞，将沉淀重悬于 300 μL 分离缓冲液、100 μL FC 受体人 IgG 封闭试剂和 100 μL CD34 磁珠中，每 1 次 10 至第八个细胞。轻轻混合细胞，然后将它们置于 4 摄氏度下孵育 30 至 40 分钟。

在孵育过程中，将适当大小的磁珠分离柱放入相应的磁珠支架中，并用 3 mL 分离缓冲液清洗色谱柱。孵育结束时，在 5 至 10 mL 分离缓冲液中离心去除未结合的磁珠，并将磁珠和细胞沉淀重新悬浮在 1.5 mL 新鲜分离缓冲液中。将标记的细胞上样到色谱柱上，并将未标记的流出物收集在 15 mL 收集管中。

将流出物装回色谱柱上，并将第二轮流出物收集到同一收集管中。然后用 3 毫升分离缓冲液洗涤色谱柱 3 次，并从磁力架上取下色谱柱。使用色谱柱柱塞，通过色谱柱逐渐将 2 mL 分离缓冲液冲洗到新的 15 mL 试管中，然后将色谱柱放回磁力架上。

将冲洗的细胞装回色谱柱上。收集流出物并用 2 mL 分离缓冲液洗涤色谱柱，如刚才所示。从磁力架上取下色谱柱后，用 2 毫升新鲜分离缓冲液冲洗色谱柱，以收集刚才所示的 CD34 阳性细胞组分，并通过离心收集 CD34 阳性细胞。

然后将沉淀重悬于 CD34 阳性细胞的无血清培养基中。对于巨核细胞分化，在 2 毫升无血清培养基中每毫升接种 5 x 10 至第五个 CD34 阳性细胞，在 12 孔板中每孔补充有重组人血小板生成素，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育，在潮湿的气氛中。在适当的分化监测时间点，在每个时间点从两到三个孔中收获细胞，而不干扰其他孔中的细胞，并用抗 CD41 和抗 CD42a 抗体对收集的细胞进行染色，以确定培养物中成熟巨核细胞的百分比。

为了在细胞表面标志物处进行显微镜观察，在 1 毫升分离缓冲液中洗涤收获的细胞，并将沉淀重悬于 100 微升新鲜缓冲液中。使用 cytospin 将细胞接种到载玻片上，然后将细胞固定在载玻片上，浸没在甲醇中 30 秒。风干后，用 20 微升补充 DAPI 的封固剂标记细胞，并用盖玻片盖住细胞，以便通过荧光显微镜进行观察。

要对血小板进行计数，请在分化的第 8 天或第 9 天收获细胞，并以每 200 微升新鲜无血清培养基的 1 x 10 至第四个细胞接种收集的细胞，在 48 孔板中每孔补充有重组人血小板生成素。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下 5 天后，在倒置光学显微镜上使用 10 或 20 倍物镜计算每孔携带血小板的前核细胞的数量。为了分析血小板活化，在培养的第 14 天或第 15 天，用巴斯德移液管轻轻混合细胞，并收集 100 微升细胞。

向细胞中加入 1 ml Tyrode 缓冲液，并通过离心沉淀。收集上清液进行离心，使血小板大小的颗粒沉淀，并将颗粒重悬于 100 微升新鲜的 Tyrode 缓冲液中，然后用抗 PAK1 抗体标记颗粒，在室温下用二磷酸腺苷活化它们 20 分钟，并通过流式细胞术分析 PAK1 阳性事件的百分比。脐带血中 CD34 阳性细胞的典型百分比约为 1.3%，分离后 CD34 阳性 CD45 阳性细胞的纯度范围为 90% 至 99%CD41 阳性巨核细胞在无血清 CD34 阳性细胞培养物中早期观察到，成熟 CD41 阳性 CD42a 阳性巨核细胞的百分比在第 7 天达到 30% 至 40%，在分化第 10 天和第 12 天之间观察到最高水平的双阳性细胞。

培养的巨核细胞表现为大的、通常是多核细胞，在其细胞质中表达 CD42b 血管血友病因子和 P-选择素。在这些细胞培养物中也通常观察到至少三类倍性。携带前血小板（从巨核细胞体延伸出的长串珠状纤维）的巨核细胞的百分比通常约为 1.3%细胞培养上清液中的大多数血小板落在外周血小板的分析门内，CD41 血小板标志物呈阳性，可被血小板激动剂如二磷酸腺苷激活，如激活特异性 PAK1 单克隆抗体的结合增加所证明。

看完这个视频，你应该对如何从脐带血中分离CD34阳性细胞有一个很好的了解。您还应该能够建立巨核细胞分化培养物，计数前血小板，并分析体外产生的血小板和巨核细胞。不要忘记，处理人类样本可能很危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在 II 类生物安全柜中工作。