Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto

El objetivo general de los métodos quirúrgicos presentados aquí es establecer modelos in vivo de infección intracraneal por el virus del Zika. Este método puede ayudar a abordar las preguntas clave en el campo, como la patología y el mecanismo de la infección por el virus del Zika en el cerebro, tanto en la etapa temprana y tardía del desarrollo como en la etapa adulta. La principal ventaja de esta técnica es que la infección de la dirección del cerebro se puede lograr fácilmente.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las terapias o diagnósticos de la microcefalia inducida por el virus del Zika u otros trastornos del desarrollo neurológico. Si bien este método puede proporcionar información sobre la patogénesis del virus del Zika, también se puede aplicar para estudiar otras infecciones por flavivirus en el cerebro, como el virus del dengue. Justo antes de la cirugía, cargue la mezcla inyectable para el virus del Zika en una aguja de inyección de vidrio preparada ensamblando primero la jeringa de inyección hermética de 50 microlitros, el accesorio Luer-lock y el tubo.

Sature la jeringa y el tubo ensamblados con aceite mineral. Una vez saturado, coloque la aguja y extraiga aproximadamente de seis a siete microlitros de virus en la aguja. Después de anestesiar a una madre embarazada con embriones E14.5, pruebe la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie o la cola.

Cuando se logra un plano quirúrgico de anestesia, asegúrese de que el dique esté acostado en decúbito supino sobre una almohadilla térmica. Afeitar la superficie del abdomen y esterilizar con yodo y alcohol tres veces. Cubra la piel que rodea el sitio quirúrgico con paños estériles para evitar la contaminación de la incisión y los instrumentos.

Pellizque y levante la piel del abdomen con fórceps, luego use tijeras estériles para hacer un corte de 1 a 1 1/2 centímetro en la parte inferior del abdomen en la línea medial-sagital y exponga los embriones. A continuación, corte una hendidura en el centro de una pequeña gasa estéril y colóquela sobre la abertura quirúrgica. Hidratar la abertura y la gasa con solución salina estéril.

Luego, tire de los embriones a través de la ranura para que descansen sobre la gasa, teniendo cuidado de no extraer más de cuatro o cinco embriones a la vez. Hidratar los embriones con solución salina estéril antes y durante la inoculación para asegurarse de que no se sequen. Ilumine el embrión que se va a inyectar con una lámpara para visualizar las suturas de la cabeza y el cráneo, luego coloque suavemente una espátula debajo de la cabeza del embrión que se va a inyectar y manipule el embrión hasta que la cabeza se empuje directamente contra la pared uterina.

Sostenga el embrión en su lugar con la mano no dominante. Use la jeringa para inyectar el virus del Zika o un medio de control en los ventrículos laterales del cerebro del embrión. Para la inyección intrauterina de la etapa E11.5, use una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 27 para inyectar el virus del Zika o un medio de control en el espacio intrauterino.

Para mejorar la retención del embarazo, evite inyectar los dos embriones junto a los ovarios y los dos embriones junto a la parte superior de la vagina. Si realiza una inyección intrauterina, inyecte en el espacio intrauterino o en la placenta. Vuelva a colocar los embriones en la madre embarazada y llene la cavidad abdominal con aproximadamente 0,5 mililitros de solución salina estéril.

Suturar tanto el músculo peritoneal abdominal como la capa externa de la piel con suturas estériles 4-0. Mantenga el dique sobre una almohadilla térmica y un monitor mientras se recupera de la anestesia. Descongele el virus en hielo, luego cargue la jeringa llenándola con solución salina para reducir el volumen muerto en la jeringa.

Extraiga hasta 0,75 microlitros de aire para separar la solución salina del material de inyección. Para configurar una cámara de recuperación calentada y humidificada, coloque un recipiente que se pueda cerrar con una gasa estéril en una caja de calor a 37 grados centígrados y remojela con solución salina. Después de configurar la bomba y el controlador del microinyector, cargue la jeringa de inyección con virus y esterilice el soporte del cabezal de la bomba de la configuración quirúrgica con etanol al 70%.

Luego, después de crioanestesiar a las crías neonatales durante cinco minutos, asegúrese de que haya suficiente anestesia para la inyección por la falta de respuesta a un pellizco de la cola o los dedos de los pies. Coloque el cachorro en el soporte de la cabeza. Esterilice la superficie de la cabeza con yodo, luego con etanol y luego séquela con una toallita con alcohol.

Marque lambda con un marcador negro, luego mida la distancia desde lambda hasta el borde del ojo y, usando coordenadas estereotáxicas, calcule la distancia de 2/5 desde lambda hasta el ojo. A continuación, utilice una aguja de calibre 26 para perforar cuidadosa y superficialmente el cuero cabelludo y el cráneo en el lugar de la inyección y crear una abertura para la aguja de inyección. A continuación, baje la aguja de inyección en el lugar de la punción y, una vez que la aguja haya atravesado la piel, calcule una profundidad de un milímetro para la inyección en el ventrículo lateral utilizando el instrumento estereotáxico.

Una vez que la aguja se baja a la profundidad de inyección, inyecte un microlitro de virus a una velocidad de 10 nanolitros por segundo. Espere 30 segundos después de la inyección y luego retraiga la aguja en incrementos de 0,5 milímetros girando el tornillo dorsalmente, esperando 30 segundos después de cada incremento para reducir la fuga del virus inyectado. Después de terminar la inyección, transfiera al cachorro a la cámara humidificada precalentada y controle hasta que se recupere.

Inmovilice la cabeza de un ratón adulto anestesiado en el instrumento estereotáxico y coloque una almohadilla térmica debajo del ratón. Después de un pellizco en el dedo del pie o la cola para asegurar un plano quirúrgico de anestesia, afeite el cuero cabelludo desde detrás de los ojos hasta el comienzo de las orejas. Esterilizar la piel expuesta con yodo y etanol al 70%.

Después de hacer una incisión de 0,5 centímetros a lo largo de la línea medial-sagital de la cabeza en el lugar esterilizado para exponer el bregma, limpie la superficie del cráneo de tejidos meníngeos y, al mismo tiempo, aleje la piel de los sitios de inyección. Alinee la broca quirúrgica con el bregma y, a continuación, identifique el lugar de la inyección por las coordenadas estereotáxicas. Con el pedal de control, perfore lentamente el cráneo hasta que el orificio esté despejado para la aguja.

Reemplace la broca con la bomba de microinyector y la jeringa hermética al gas de 10 microlitros. Deje una pequeña burbuja de aire entre la solución salina y el virus y extraiga de cuatro a cinco microlitros de virus. Baje la aguja a 1,5 milímetros por debajo de la superficie del cerebro desde la superficie del cerebro e inyecte un microlitro de virus a una velocidad de 10 nanolitros por segundo, inyectando el microlitro durante 1 1/2 minutos.

Después de retirar la aguja del cerebro en incrementos como antes, use fórceps para aflojar la piel y volver a cubrir el cráneo expuesto. Una vez que el cuero cabelludo se haya suturado con suturas 4-0, retire el mouse de la estereotasa y controle en una almohadilla térmica hasta que se recupere. Las células neuroprogenitoras están inmunomarcadas con Pax6, visto en rojo, y el virus del Zika a través de antígenos de flavivirus, visto en verde, cuatro días después de la inyección en E18.5.

El cerebro embrionario está infectado con la cepa MEX1-44 del virus del Zika en todas las capas del neocórtex en desarrollo. El ensayo TCID50 que utiliza tejido del tercer día cerebral posnatal inoculado con E14.5 muestra que el virus del Zika puede replicarse y crecer de manera eficiente en cerebros en desarrollo. Esta imagen muestra la infección por el virus del Zika MEX1-44 en la corteza cerebral P13 después de la inyección de P0.

El zika se detecta utilizando un anticuerpo contra el antígeno del grupo de los flavivirus que se ve en rojo. Estas imágenes muestran las perlas fluorescentes que se utilizaron para practicar la ubicación de la inyección y el éxito de la inyección en el ventrículo lateral en adultos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar llevar un registro de los embriones inyectados, tener controles adecuados y mantener las heridas quirúrgicas pequeñas.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inyección intraperitoneal o arterial, para responder a la pregunta adicional, como cómo el virus del Zika atraviesa la placenta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar el modelo de ratón in vivo de la infección por el virus del Zika en el cerebro.