Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Bu tekniğin genel amacı, drosophila larva nöromüsküler kavşağındaki görselleştirilmiş sinaptik butonların sinaptik aktivitesini izlemektir. Genetik manipülasyonlara kolayca değiştirilebilen mükemmel bir model sistemi. Bu teknik, biliminizdeki temel soruları ele alabilir.

Sinaptik proteinlerin mutasyonlarının sinaptik iletimi nasıl düzenlediği gibi. Bu tekniğin temel avantajı, sınırlı sayıda serbest bırakma bölgesinin aktivitesinin, hızlı kinetik akımlarının izlenebilmesi ve kaydedilebilmesi ve kolayca çözülebilmesidir. Deneye başlamak için:mikroelektrot çekicisini hazırlayın.

Çekilen elektrotun iç çapının yedi ila on mikrometre aralığında olduğundan emin olmak için 35X büyütmede bir mikroskop kullanın. Toz birikmesini önlemek için kılcal damarları sıkıca kapalı kaplarda saklayın. Ardından, bir mikro dövme kullanarak cilalı kılcal damarları ateşleyin.

Cilalı elektrotun son iç çapının beş mikrometre olduğundan emin olun. Ardından, bükmeye geçin. Elektrodu manipülatöre sabitleyin ve ucu filamanın üzerine dokunmayacak şekilde yerleştirin.

Isı değerini maksimumun %60-70'ine ayarlayın ve filamenti ısıtmak için mikro dövmenin pedalına bir ila iki saniye basın. Elektrotun ucunu nazikçe aşağı çekmek için L şeklinde bir iğne kullanın ve bükümü yaklaşık 90 derece yapın. Elektrodu elinizle torcun alevi üzerinde tutun ve ikinci bükümü ilk virajdan yedi ila on milimetre uzakta ve yaklaşık 120 derecelik bir açıyla yapın.

Hemolenf benzeri veya HL3 çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi refigeratörde tutun ve her hafta taze hale getirin. Stimülasyon pipetlerini, cam pipetleri bükmeden kayıt yapıyormuş gibi hazırlayın.

Ardından, bir şırıngaya bağlı bir mikroelektrot tutucusuna bir stimülasyon pipeti yerleştirin. Silikon kauçuk epoksi ile kaplanmış küçük Petri kaplarından üretilen diseksiyon plakaları. Daha sonra, forseps kullanarak bir şişeden dolaşan üçüncü bir instar larvası seçin.

Larvaları, ilk pimi arkaya ve başka bir pimi ağız kancalarına yakın bir yere yerleştirerek sabitleyin. HL3 çözeltisi ekleyin. Larvaların sırt tarafında, yaylı makas kullanarak üst pimden alt pime doğru bir kesim yapın.

Larvaların sol ve sağ taraflarına iki ek pim yerleştirerek larva filetosunu sabitleyin. Forseps kullanarak bağırsakları ve trakeayı çıkarın. Yaylı makas kullanarak ventral sinir kordonunun hemen dışındaki sinirleri kesin.

Preparatla birlikte petri kabını mikroskop tablasına yerleştirin. Referans elektrodunu banyoya yerleştirin. Kayıt elektrodunu HL3 solüsyonu ile doldurun.

10X objektifinin altında, elektrodu banyoya daldırın ve mikro manipülatörü kullanarak iki, üç veya dört karın kaslarının altı ve yedisinin üzerine yerleştirin. Ardından, hedefi 60X'e getirin ve epi-floresan veya DIC optiklerini kullanarak ilgilenilen alana odaklanın. Elektrotun ucunu sinaptik butonun üzerine yerleştirin, ardından elektrodu kasın üzerine çok nazikçe bastırın, çünkü aşırı basınç NMJ'ye zarar verebilir veya spontan sinaptik aktivitede bir artışa neden olabilir.

Ardından, amplifikatörü, AD kartını ve bilgisayarı açın. Ardından, amplifikatör üzerinde voltaj kelepçesi modunu seçin. Alım yazılımını başlatın ve boşluksuz modu seçin ve bilgisayar ekranında MEJC'lerin görünümünü gözlemleyin.

MEJC'lerin genliğinin 0,2 ila 0,7 nanoamper aralığında olduğundan emin olun. Görsel bir kontrol altında bir mikro manipülatör kullanarak, stimülasyon elektrodunu aksonun yakınına yerleştirin ve abdominal segmentleri iki ila dört arasında innerve edin. Elektrot tutucusuna bağlı şırınganın pistonunu çekerek negatif basınç uygulayın, böylece akson elektrotun içine çekilir.

Ardından, stimülatörü açın. Sıfır akımı ayarlamak için izolasyon ünitesindeki düğmeyi çevirin ve ardından EJC'ler görünene veya eşiğe ulaşılana kadar yavaşça artırın. Stimülasyonu bir süper eşik rejiminde gerçekleştirin.

Stimülasyon akımı ile EJC'lerin gözlemlenmesi için eşik değere kıyasla yaklaşık iki kat artar. Test konumunu sızdırmaz hale getirmek için amplifikatörün elektrot direnç anahtarını çevirerek kayıt yapan makro yama elektrodunun sızdırmazlık direncini ölçün. Geçerli pencerede görüntülenecek olan giga ohm cinsinden sızdırmazlık direncinin değerini gözlemleyin.

Odak makro yama kayıtları, seçilen sinaptik boutonlardan sinaptik aktivitenin izlenmesini sağlar. Elektrot bir sinaptik butonun üzerine yerleştirildiğinde, kaydedilen MEJC'ler, gürültü seviyesini önemli ölçüde aşan genliklere ve milisaniyenin altında bir aralıkta keskin yükselen fazlara sahiptir. Kayıt elektrodu sinaptik bouton'dan birkaç mikron uzağa hareket ettirildiğinde, kaydedici MEJC'lerin genlikleri neredeyse gürültü seviyesine düşer.

Kaydedilen EJC'ler gürültüden zar zor ayırt edilebilir ve uzun süreli yükselme fazlarına sahiptirler. Odak kayıtları, karmaşık ve gnome mutantındaki MEJC'lerin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bu mutanttan elde edilen hücreler arası kayıtlar, örtüşen ve güvenilir bir şekilde tespit edilemeyen olayları serbest bırakır.

Elektro çipin açılarının ayarlanması, elektrotun konumlandırılması için kritik öneme sahiptir. Bu prosedürü takiben, bireysel aktif bölgelerin aktivitesinin entegrasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için bireysel serbest bırakma olaylarının görüntülemesini kontrol etmek gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.