تطبيق نظام الثقافة Explant الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس في هيماتوبويسيس الإنمائية

الهدف العام من هذه التجربة هو استخدام ثقافة زرع الشريان الأورطي والغدد التناسلية المتوسطة للتحقيق في المنظمين الهامين لتطور الخلايا الجذعية المكونة للدم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا HSC ومجالات الوظائف حول كيفية تحديد العوامل المشاركة في تنظيم تطور HSC في الثدييات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن التحقق من هذه المنظمين من خلال تحليل تعبير الحمض النووي وقدرة تكوين المستعمرة وقدرة إعادة تكوين HSC.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الفصل الدقيق ل AGM عن الأنسجة المحيطة في منطقة الجذع يتطلب ممارسة لإتقانها. قبل البدء في الإجراء ، ضع شبكات من الفولاذ المقاوم للصدأ في آبار فردية من صفيحة من ستة آبار تحتوي على ملليلترين من وسط محضر حديثا مكمل بفلوكستين لكل بئر. ضع مرشحا واحدا معقما بالأشعة فوق البنفسجية سعة 0.65 ميكرولتر لكل بئر تجريبي في طبق زراعة الخلايا الزجاجية الذي يحتوي على ماء مغلي عذب لمدة غسلتين لمدة ثلاث دقائق ، وغمر المرشحات في وعاء من PBS بدرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين بعد كل غسلة.

ثم ضع مرشحا واحدا على كل شبكة فولاذية في واجهة الهواء السائل لكل بئر. بعد ذلك ، استخدم مقص التشريح لتجريد الرحم من فأر حامل في اليوم 11 من الجنين وحصاد الأجنة من الرحم. باستخدام مقص التشريح ، قم بإزالة كيس الصفار والحبل السري والأحشاء من جسم الجنين.

وإزالة الأنسجة العصبية الظهرية والأنسجة العضلية المحيطة بعناية. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الأنسجة من الأطراف الأمامية والخلفية. وفصل منطقة AGM عن جسم الجنين.

ثم ضع كل AGM على مرشح واحد في واجهة الهواء السائل لكل بئر. ضع المزارع في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد يومين إلى ثلاثة أيام ، قم بنقل عينات AGM إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.5 مليلتر تحتوي على 200 ميكرولتر من الكولاجيناز لتفكيكها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا مع الرج كل خمس دقائق.

في نهاية الهضم ، أوقف التفاعلات مع 200 ميكرولتر من المصل لكل نبتة. انقل محتويات كل أنبوب بالكامل إلى آبار فردية من لوحة مرفقة منخفضة للغاية مكونة من 24 بئرا تحتوي على 500 إلى 600 ميكرولتر من متوسط M3434 لكل بئر. امزج الخلايا في كل بئر بحقنة ملليلتر واحد بدون إبرة.

ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. يمكن بعد ذلك تسجيل عدد وحدات تكوين المستعمرات داخل كل بئر بعد سبعة إلى 10 أيام من الاستزراع. بالنسبة لزرع الزرع في الجسم الحي AGM بعد يومين إلى ثلاثة أيام من ثقافة AGM كما هو موضح للتو ، قم بإشعاع ستة فئران سوداء من الذكور C57 البالغة من العمر ثمانية إلى 10 أسابيع مع تسعة رمادي من الإشعاع.

بعد أربع إلى خمس ساعات ، قم بفصل النباتات المسبقة المحصودة في 200 ميكرولتر من الكولاجيناز لكل عينات كما هو موضح. حمولة 0.5 إلى جنين واحد مكافئ من المعلقات أحادية الخلية الناتجة في حقنة واحدة سعة مليلتر واحد لكل متلقي. ضع أول فأر مشع في مصفاة وامسح الذيل بقطعة قطن مبللة بالإيثانول بنسبة 75٪ لتعزيز توسع الأوعية في وريد الذيل.

حقنة واحدة بالكامل عن طريق الوريد في وريد الذيل المتوسع. استخدم مسحة مطهرة لوقف النزيف بعد إزالة الإبرة. ثم أعد إلى قفصه ، وحقن التالي.

بعد 11 يوما من النقل بالتبني ، يمكن تثبيت الطحال في محلول بوين للتعداد العياني لمستعمرات الطحال المرئية. تظهر مزارع AGM المكملة بفلوكستين تعبيرا متزايدا عن Runx1 ، وهو جين محوري لتطور HSC على مستويات mRNA والتعبير عن البروتين. يمكن أن يزيد فلوكستين أيضا بشكل كبير من قدرة تكوين مستعمرة HSC في AGM بما في ذلك الأحمر الوحمي لوحدة تشكيل الانفجار ، والخلايا الوحيدة الحبيبية لوحدة تشكيل المستعمرات والخلايا الحبيبية لوحدة تكوين المستعمرة ، وكريات الدم الحمراء ، والضامة ، والخلايا الضخمة النواة.

علاوة على ذلك ، يؤدي زرع HSC المعالج بالفلوكستين المعزول من AGM إلى زيادة أعداد المستعمرات في طحال المتلقية البالغة المشععة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل AGM وإجراء ثقافة الزرع AGM لتحديد المنظمين الهامين لتطوير HSC داخل AGM.