기능성된 10 nm 폴리머-코팅 된 금 입자 피 대상에 대 한 및 약물 전달의 합성

이 절차의 전반적인 목표는 직경이 10나노미터이고 생체 적합성이 있으며 순환 시간이 길고 형광 현미경으로 이미지화할 수 있는 기능화된 폴리머 코팅된 금 나노구를 합성하는 것입니다. 이 방법은 질병 상태에서의 내피 투과성에 대한 심장학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 추가 맞춤화가 가능한 작용기를 가진 생체 적합성 초소형 입자를 생성한다는 것입니다.

먼저 마이크로 원심분리기 튜브에 12마이크로리터의 80%THPC를 1ml의 초순수로 희석합니다. 100밀리리터의 둥근 바닥 플라스크를 자기 교반 플레이트 위에 고정합니다. 플라스크에 물 45ml와 작은 달걀 모양의 젓는 막대를 넣습니다.

300RPM으로 물을 저어주기 시작합니다. 플라스크에 0.5 밀리리터의 1 몰 수산화 나트륨 용액과 1 밀리리터의 묽은 THPC 용액을 첨가합니다. 5분 동안 반응 혼합물을 계속 격렬하게 저어줍니다.

그런 다음 교반하면서 25 밀리 몰의 클로로오우르산 용액 2 밀리리터를 반응 혼합물에 첨가합니다. 노란색 반응 혼합물이 몇 초 안에 짙은 갈색이 되는 것을 확인하여 THPC로 덮인 음전하를 띤 금 나노 입자의 형성을 나타냅니다. 15분 동안 혼합물을 계속 저어줍니다.

혼합물이 교반하는 동안, 이종 작용성 아민 PEG 티올, 카르복시 메틸 PEG 티올 및 단일 기능 메톡시 PEG 티올의 수용액을 준비합니다. 금 나노 입자 반응 혼합물이 15 분 동안 교반 된 후 교반 속도를 100 RPM으로 줄이십시오. 저어주는 동안 PEG 용액을 혼합물에 현명하게 떨어뜨립니다.

실온에서 밤새 혼합물을 부드럽게 저어줍니다. 그런 다음 투석 클립으로 12-14 킬로달톤 MWCO 셀룰로오스 멤브레인의 한쪽 끝을 닫습니다. 피펫을 사용하여 반응 혼합물을 멤브레인으로 옮깁니다.

두 번째 투석 클립으로 멤브레인의 다른 쪽 끝을 닫습니다. 60RPM에서 72시간 동안 교반된 물 4리터에 나노 입자 혼합물을 투석합니다. 처음 6시간 동안은 2시간마다, 그 이후에는 6시간에서 12시간마다 물을 갈아줍니다.

그런 다음 0.2 마이크로 미터 주사기 필터를 통해 반 정제 된 pegylated 금 나노 입자 혼합물을 50 밀리리터 원추형 튜브에 여과합니다. 정제된 나노 입자 용액을 섭씨 영하 80도에서 약 5시간 동안 동결합니다. 동결 건조기를 사용하여 정제된 나노 입자를 동결 건조합니다.

형광 pegylated 금 나노 입자를 준비하기 시작하려면 100ml의 둥근 바닥 플라스크를 자기 교반 플레이트 위에 고정합니다. 플라스크에 초순수 18ml와 작은 달걀 모양의 교반 막대를 넣고 100RPM으로 저어주기 시작합니다. 4 밀리리터 원뿔형 튜브에 2 밀리그램의 동결 건조 페길화 금 나노 입자와 2 밀리리터의 물을 결합하십시오.

그런 다음 나노 입자 용액을 둥근 바닥 플라스크로 옮겨 추가 재구성을 위해 사용합니다. 교반하면서 재구성된 나노입자에 pH 8.8, 0.1 몰 탄산염 완충액 1ml를 첨가합니다. 그런 다음, 디메틸 설폭 사이드에 형광 anhydroxysuccinimide 에스테르의 밀리리터 당 10 밀리그램 용액 5 마이크로 리터를 첨가한다.

플라스크를 호일로 싸서 빛을 완전히 차단합니다. 형광 나노 입자 혼합물을 실온에서 밤새 계속 저어줍니다. 그런 다음, pegylated 금 나노 입자의 제조에 설명 된 절차를 사용하여 72 시간 동안 4 리터의 물에 혼합물을 투석합니다.

투석 내내 용기를 호일로 덮은 상태로 유지하십시오. 특성 분석을 위해 1ml의 정제된 형광 pegylated 나노 입자를 따로 보관하십시오. 나머지 형광 나노 입자를 동결, 동결 건조 및 섭씨 4도에서 보관합니다.

투과 전자 현미경으로 금 나노 입자 코어를 시각화하기 위해 먼저 탄소로 코팅 된 메쉬 TEM 그리드에서 정제 된 형광 나노 입자 용액의 10 마이크로 리터를 배치하십시오. 방울을 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 여과지를 사용하여 형광 나노 입자의 필름만 그리드에 남을 때까지 TEM 그리드의 가장자리에서 과도한 유체를 조심스럽게 흡수합니다.

나노 입자를 80 킬로 볼트에서 50, 000에서 150, 000의 배율로 이미지화합니다. 유체역학적 나노 입자 크기를 측정하려면 동결 건조된 THPC 코팅된 금 나노 입자 1mg을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 각 튜브에 1ml의 물을 넣고 용액을 1ml의 투명 플라스틱 큐벳에 옮깁니다.

동적 광 산란으로 각 용액을 평가하고 입자의 구형 유체역학적 직경을 측정합니다. 그런 다음 형광 pegylated 금 나노 입자가 포함된 큐벳을 분광 형광계로 옮깁니다. 엑소테이션 파장을 633나노미터로 설정하고 650에서 800나노미터의 방출 신호를 읽습니다.

다음으로, 7개의 나노입자 농도에서 생체 적합성을 평가하기 위해, 먼저 DMEM에서 쥐 지방 패드 내피 세포 현탁액 100마이크로리터를 96웰의 투명한 바닥 멸균 조직 배양 플레이트의 21개 웰 각각에 피펫으로 주입합니다. 농도가 달성될 때까지 세포를 배양한 다음, 밀리리터당 0에서 1000마이크로그램 범위의 농도를 가진 DMEM에서 7개의 형광 나노 입자 용액을 얻습니다. 우물에서 DMEM을 흡입합니다.

7개의 나노 입자 용액 각각을 100마이크로리터의 개별 웰 각각에 세 번 놓습니다. 세포와 나노 입자가 16시간 동안 함께 배양하도록 합니다. 그런 다음 DMEM을 흡인하고 웰에서 현탁 또는 느슨하게 부착된 나노 입자를 흡입합니다.

20마이크로리터의 MTS/PES 용액이 들어 있는 100마이크로리터의 새로운 DMEM을 각 웰에 추가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트 리더를 사용하여 492나노미터에서 클로로메트릭 분석을 통해 세포 생존율을 평가합니다.

다음으로, 멸균 12 밀리리터 유리 덮개에 종자 쥐 뚱뚱한 패드 내피 세포는 10, 평방 센티미터 당 000 세포에서 미끄러진다. 10%FBS와 1%페니실린 스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 세포에 공급합니다. 완전한 포화도가 달성될 때까지 세포를 배양합니다.

원하는 경우 내피 글리코칼릭스를 변형한 다음 16시간 동안 밀리리터당 550마이크로그램의 형광 금 나노 입자로 세포를 배양합니다. 면역형광 현미경 검사를 위해 세포를 준비합니다. DAPI가 포함된 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 각 커버 슬립을 장착합니다.

매니큐어로 커버 슬립 가장자리를 밀봉하십시오. 컨포칼 현미경으로 면역 염색된 내피 세포를 이미지화합니다. 핵, 헤파린 설페이트 글리코칼릭스(heparin sulfate glycocalyx) 및 나노 입자를 각각 파란색, 녹색 및 근적외선 채널이 있는 시각화합니다.

THPC에 의하여 입힌 금 nanoparticles의 TEM는, 2개에서 3개의 나노미터의 입자 직경을 보여주었습니다. PEG는 TEM 이미지에서 볼 수 없기 때문에 pegylted 나노 입자의 TEM은 분산된 입자의 존재만 확인할 수 있습니다. THPC 코팅 및 페길화된 나노 입자의 DLS는 피크 입자 직경이 2.5나노미터에서 10.5나노미터로 이동하는 것을 보여주었습니다.

형광 방출은 633 나노 미터의 빛으로 여기되었을 때 최대 660 및 672 나노 미터 사이를 가졌으며, 이는 사용 된 형광 프로브의 665 나노 미터에서 예상되는 최대 방출과 일치했습니다. 쥐 뚱뚱한 패드 내피 세포는 밀리리터당 최대 1밀리그램의 농도로 형광 페골화 금 나노입자와 함께 배양 16시간 후 유사한 수준의 생존력을 보였으며, 이는 나노 입자로부터 상당한 독성이 없음을 나타냅니다. 건강한 글리코칼릭스를 가진 쥐 지방 패드 내피 세포에서 최소한의 나노 입자 흡수가 관찰되었습니다.

나노 입자에서 적색 형광 신호의 증가로 나타난 바와 같이 분해된 글리코칼릭스가 있는 세포에서 훨씬 더 큰 흡수가 발생했습니다. 이 절차에 따라, 개방 작용기에 대한 접합과 같은 추가 변형을 수행하여 내피 성분의 특정 표적화 또는 약물 전달을 위해 입자를 변형할 수 있습니다.