Méthodes de purification de biomolécules basées sur la chromatographie
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개요
En biochimie, méthodes de purification axée sur la chromatographie sont utilisés pour isoler les composés d’un mélange complexe. Deux de ces méthodes utilisées couramment par les biochimistes est la chromatographie d’exclusion stérique et chromatographie d’affinité. En chromatographie d’exclusion stérique, une colonne regorge de perles poreuses sépare les composants d’un mélange selon la taille. En revanche, la chromatographie d’affinité permet une séparation plus spécifique des biomolécules en utilisant une colonne qui est composée d’une phase stationnaire, qui contient des ligands spécifiques à la cible.
Cette vidéo sert d’introduction à exclusion stérique et chromatographie d’affinité, ainsi que les concepts qui les gouvernent. On décrit une méthode étape par étape pour la purification d’une protéine histidine-étiquetée par chromatographie d’affinité métallique immobilisée. Demandes pour les deux méthodes chromatographiques en biochimie et en recherche biomédicale sont également présentés.
« Chromatographie » se réfère à un large éventail de méthodes utilisées pour isoler un composant d’un mélange complexe, une étape essentielle avant d’une biomolécule propriétés et activités peuvent être déterminées. Chaque technique chromatographique a un mécanisme différent pour la séparation, selon la matrice de l’échantillon et le composé cible. Cette vidéo mettra l’accent sur les principes et le fonctionnement des deux méthodes communes de biochimie : chromatographie d’exclusion stérique et affinité.
Chromatographie d’exclusion stérique ou SEC repose sur la taille des composés dans l’échantillon. Une phase mobile contenant l’échantillon est ajoutée à une colonne avec un matériau poreux : la phase stationnaire. Les molécules de l’échantillon tombent dans 1 des 3 catégories.
Trop grand pour entrer dans les pores des molécules de voyage la plus courte distance par le biais de la colonne. Toutes les espèces dont le poids moléculaire au-dessus de cette « limite d’exclusion » quittera la colonne en même temps. Assez petit pour entrer librement dans les pores des molécules seront conservés le plus longtemps et sortira la colonne ensemble. Le poids moléculaire permettant l’entrée de pore complet est la « limite de perméation ».
Seulement des molécules entre ces limites seront séparés entre eux, car ils dépensent des quantités variables de temps diffusant dans et hors des pores. Molécules plus petites sont conservés plus longtemps sur la colonne car ils passent plus de temps dans la phase stationnaire, tandis que les plus grosses molécules dans ces limites quitter plus tôt.
Des poids moléculaires dans 1 à 2 ordres de grandeur se situent dans ces limites. Les colonnes sont choisis avec cela à l’esprit, ou plusieurs colonnes peuvent être utilisées en série s’il existe un large éventail de composés désirés.
Maintenant que vous avez vu la théorie de la SEC, regardons comment elle est réalisée.
Pour commencer la procédure de la SEC, la colonne doit être équilibrée avec l’eau désionisée et tampon de chromatographie. Une fois préparée, tampon contenant l’échantillon est injecté sur la colonne. La mémoire tampon est ensuite poussé par un débit faible. Un détecteur surveille ce qui sort de la colonne pour déterminer la présence de l’analyte désirée. Grosses molécules de poids moléculaire supérieur à la limite d’exclusion sortie la colonne en même temps. Petites fractions de la colonne sont collectées dans des tubes. Chaque fraction est testée pour la qualité de la molécule cible par électrophorèse sur gel ou d’autres techniques d’analyse.
Maintenant nous allons jeter un oeil à la chromatographie d’affinité ou AC, l’un des moyens plus efficaces pour purifier les protéines. Nombreuses biomolécules lient sélectivement à certains biens de ligands-a qui AC utilise en adhérant à un ligand spécifique à la cible à la phase stationnaire.
Lorsque le mélange s’écoule à travers la colonne, les molécules cibles fixer sur le ligand et le débit de repos. Le mélange expiré par le biais de la colonne, la molécule cible peut être collectée au moyen d’une des deux méthodes d’élution basées sur la spécificité.
Biospecific élution peut être considérée un avoir un « normal » ou « inverse-rôle ». Dans biospecific normal-rôle d’élution, un agent est ajouté qui rivalise avec le ligand collé à lier avec la biomolécule cible.
Dans biospecific inverse-rôle d’élution, un agent est en concurrence avec l’objectif de se lier au ligand collé. Le deuxième type d’élution, non-spécifique à élution, abaisse la liaison ligand-à-cible en changeant la pH, force ionique ou solution polarité. Si une protéine ne soit pas lié à un ligand qui peut être immobilisé, la protéine peut être exprimée en contenant un « tag » : courtes séquences peptidiques conçus pour se lier au ligand.
Une variété est une chromatographie d’affinité immobilisée ion métallique, « IMAC » pour faire court, où un ligand métallique collé, comme le nickel ou cobalt, se lie aux résidus d’histidine sur la protéine modifiée. Par le biais de techniques de biologie moléculaire, protéines cibles sont générés avec la répétition des résidus d’histidine, appelés polyhistidine-étiquette, qui se lie au métal par l’intermédiaire de la chaîne latérale imidazole sur histidine. Une fois lié, la protéine peut être rassemblée d’imidazole gratuit via inverse-rôle spécifique d’élution et plus tard utilisé dans un large éventail d’applications en aval.
Maintenant que vous avez vu la théorie de la chromatographie d’affinité, regardons une procédure IMAC en laboratoire.
En IMAC, la phase stationnaire peut être ajoutée directement au mélange de la phase mobile et échantillon, permettant la liaison de la protéine de son étiquette. Ce coulis est ensuite versé dans la colonne, où le non lié aux composés goutte à goutte dans les déchets, tandis que la boue reste. Le conteneur de lisier est rincé pour recueillir la résine résiduelle et l’échantillon, qui est ajoutée à la colonne.
La résine est agitée pour s’assurer que les composants non liés sont à écoulement libre. Ajouté le lavage tampon contribue à les nettoyer. Après ont enlevé tous les composants non liés, le déchet est remplacé avec un récipient pour recueillir la protéine cible.
Mémoire tampon contenant l’imidazole est ajouté, agité et laisser reposer pour dissocier la molécule cible. L’imidazole lie au métal, en remplaçant et en relâchant la protéine étiquetée. La protéine libérée est recueillie, et l’étape de l’imidazole est répétée pour assurer le recouvrement total. Pour plus amples purifier l’échantillon, SEC peut être exécuté sur l’échantillon avant l’analyse.
Maintenant que nous avons vu la théorie et l’intérieur de ces deux techniques, regardons quelques-unes des façons qu’elles sont appliquées dans le domaine biochimique.
Une raison courante pour purifier les protéines est d’étudier leur rôle dans la maladie. Fibrose kystique est causée par des défauts dans les protéines de régulateur conductance transmembranaire de la fibrose kystique ou CFTR. Après une croissance de la protéine avec une balise son chez la levure, affinité et chromatographie d’exclusion stérique permettent l’isolement de la protéine, suivie par l’étude de sa fonction.
Dans certains cas, la présence d’une balise polyhistidine pouvez modifier la structure d’une protéine, cela n’affecte sa fonction. Une autre balise commune est la protéine liant le maltose ou MBP, qui se liera à lié amylose dans une colonne. Maltose est ensuite utilisée pour libérer le complexe. Le MBP puis peut être clivé et retiré auprès de la SEC pour produire la protéine désirée pure.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur chromatographie d’exclusion stérique et affinité. Il couvert la théorie des techniques, passe procédures générales et certaines des utilisations des techniques couverts.
Merci de regarder !
Procedure
내레이션 대본
“Chromatography” refers to a wide range of methods used to isolate a component from a complex mixture, an essential step before a biomolecule’s properties and activities can be determined. Each chromatographic technique has a different mechanism for separation, depending on the sample matrix and target compound. This video will focus on the principles and operation of two methods common to biochemistry: size-exclusion and affinity chromatography.
Size-exclusion chromatography or SEC is based on the size of the compounds in the sample. A mobile phase containing the sample is added to a column with a porous material: the stationary phase. The molecules in the sample fall into 1 of 3 categories.
Molecules too large to enter the pores travel the shortest distance through the column. Any species with a molecular weight above this “exclusion limit” will exit the column at the same time. Molecules small enough to freely enter the pores will be retained the longest, and will exit the column together. The molecular weight allowing complete pore entry is the “permeation limit”.
Only molecules between these limits will be separated from one another, as they spend varying amounts of time diffusing into and out of the pores. Smaller molecules are retained longer on the column because they spend more time in the stationary phase, whereas larger molecules within these limits exit earlier.
Molecular weights across 1 to 2 orders of magnitude fall within these limits. Columns are chosen with this in mind, or multiple columns can be used in series if there is a wide range of desired compounds.
Now that you’ve seen the theory of SEC, let’s look at how it is carried out.
To begin the SEC procedure, the column must be equilibrated with deionized water and chromatography buffer. Once prepared, buffer containing the sample is injected onto the column. The buffer is then pushed through at a low flow rate. A detector monitors what exits the column to determine the presence of the desired analyte. Large molecules with molecular weights above the exclusion limit exit the column at the same time. Small fractions from the column are collected in tubes. Each fraction is tested for the quality of the target molecule by gel electrophoresis or other analytical techniques.
Now let’s have a look at affinity chromatography or AC, one of the most efficient ways to purify proteins. Many biomolecules bind selectively to certain ligands-a property which AC utilizes by adhering a target-specific ligand to the stationary phase.
When the mixture flows through the column, the target molecules attach to the ligand, and the rest flow through. After the mixture has passed through the column, the target molecule can be collected through one of two elution methods based on specificity.
Biospecific elution can be said to a have a “normal-” or “reverse-role”. In normal-role biospecific elution, an agent is added that competes with the adhered ligand to bind with the target biomolecule.
In reverse-role biospecific elution, an agent competes with the target to bind to the adhered ligand. The second elution type, nonspecific elution, lowers the target-to-ligand binding by changing the solution’s pH, ionic strength, or polarity. If a protein does not bind to a ligand that can be immobilized, the protein can be expressed containing a “tag”: short peptide sequences engineered to bind to the ligand.
One variety is immobilized metal ion affinity chromatography, “IMAC” for short, where an adhered metal ligand, like nickel or cobalt, binds to histidine residues on the modified protein. Through molecular biology techniques, target proteins are generated with repeating histidine residues, called a polyhistidine-tag, which binds to the metal via the imidazole side chain on histidine. Once bound, the protein can be collected with free imidazole via reverse-role specific elution and later used in a wide variety of downstream applications. Now that you’ve seen the theory of affinity chromatography, let’s look at an IMAC procedure in the laboratory.
In IMAC, the stationary phase can be added directly to the mixture of mobile phase and sample, allowing the binding of the his-tagged protein. This slurry is then poured into the column, where the non-bound compounds drip into waste, while the slurry remains. The slurry container is rinsed to collect residual resin and sample, which is added to the column.
The resin is stirred to ensure the unbound components are free-flowing. Added wash buffer helps flush them away. Once all of the unbound components have been removed, the waste is replaced with a container to collect the target protein.
Buffer containing imidazole is added, stirred, and allowed to rest to unbind the target molecule. The imidazole binds to the metal, replacing and releasing the tagged protein. The freed protein is collected, and the imidazole step is repeated to ensure total collection. To further purify the sample, SEC can be run on the sample prior to analysis.
Now that we’ve seen the theory and procedure of these two techniques, let’s look at some of the ways they’re applied in the biochemical field.
A common reason to purify proteins is to study their role in disease. Cystic fibrosis is caused by defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein, or CFTR. After growing the protein with a his-tag in yeast, both affinity and size-exclusion chromatography allow the isolation of the protein, followed by the study of its function.
In some instances, the presence of a polyhistidine tag can change a protein’s structure, thereby affecting its function. Another common tag is maltose-binding protein or MBP, which will bind to bound amylose in a column. Maltose is then used to release the complex. The MBP can then be cleaved and removed with SEC to produce the pure desired protein.
You’ve just watched JoVE’s video on size-exclusion and affinity chromatography. It covered the theory of the techniques, went over general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
